基因芯片技術(shù)篩選和鑒定結(jié)直腸癌腹膜種植轉(zhuǎn)移相關(guān)基因.pdf

1、研究背景和目的:
　　 腹膜種植轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式，文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生率約13％，有7％的結(jié)直腸癌患者在首次手術(shù)時(shí)就發(fā)現(xiàn)腹膜種植轉(zhuǎn)移，另有4％～19％的患者在根治術(shù)后出現(xiàn)腹膜種植轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移的預(yù)后很差，中位生存期只有5～9個(gè)月，因此，鑒定結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)記對(duì)早期診斷及判斷預(yù)后都具有重要意義。基因芯片技術(shù)由于具有高通量檢測(cè)基因表達(dá)變化的特點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用于腫瘤生物學(xué)標(biāo)記的篩查。目前，大量

2、研究證實(shí)結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤組織和肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中存在大量差異表達(dá)基因，但腹膜轉(zhuǎn)移組織和原發(fā)腫瘤組織中有哪些基因存在表達(dá)差異，國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少。理論上，根據(jù)腫瘤平行生長(zhǎng)模型，在腫瘤發(fā)生的早期，一些不具有全部惡變基因的腫瘤細(xì)胞就可以出現(xiàn)播散，并在遠(yuǎn)處其他組織內(nèi)繼續(xù)通過(guò)基因突變來(lái)適應(yīng)新的微環(huán)境的變化，最終形成轉(zhuǎn)移灶，由于外部環(huán)境選擇的壓力和內(nèi)在基因的不穩(wěn)定性，使這些轉(zhuǎn)移細(xì)胞的基因和原發(fā)腫瘤的基因差異很大。因此，借助于基因芯片技術(shù)比較結(jié)直腸癌

3、原發(fā)腫瘤組織與腹膜轉(zhuǎn)移組織全基因組mRNA表達(dá)水平的差異，就可以找到結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。為此，我們首先從南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院普外科自主開(kāi)發(fā)的結(jié)直腸癌外科病例管理與分析系統(tǒng)軟件中提取748例結(jié)直腸癌病人數(shù)據(jù)，對(duì)臨床病理資料進(jìn)行回顧性分析，應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件探討結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生的危險(xiǎn)因素，并確定基因芯片實(shí)驗(yàn)所需的病人及標(biāo)本收集范圍。采用基因芯片技術(shù)比較4例結(jié)直腸腺癌原發(fā)腫瘤組織和配對(duì)的4例腹膜轉(zhuǎn)移組織全基因組mRNA表達(dá)水

4、平的差異，通過(guò)倍數(shù)法確定差異表達(dá)的基因，并對(duì)這組基因進(jìn)行功能注釋聚類(lèi)分析，通過(guò)對(duì)腫瘤進(jìn)展相關(guān)的功能類(lèi)中基因的分析，探討結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。由于基因芯片技術(shù)有一定的假陽(yáng)性率，因此對(duì)部分基因芯片技術(shù)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。通過(guò)上部分實(shí)驗(yàn)，我們最終確定膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1（CollagenTripleHelixRepeatContaining1，CTHRC1）與結(jié)直腸癌腹膜種植轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為近一步驗(yàn)證CTHRC1

5、蛋白表達(dá)水平的差異，采用免疫組化的方法檢測(cè)了40例正常組織、66例結(jié)直腸原發(fā)癌組織、42例腹膜轉(zhuǎn)移癌組織及5年隨訪期內(nèi)無(wú)腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生的68例結(jié)直腸原發(fā)癌組織的CTHRC1蛋白表達(dá)情況，探討CTHRC1蛋白表達(dá)與臨床病理數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，比較不同強(qiáng)度CTHRC1蛋白表達(dá)組間病人術(shù)后累積總生存率及無(wú)病生存率的差異，并以病人的臨床病理數(shù)據(jù)及CTHRC1表達(dá)水平為自變量，構(gòu)建Cox回歸模型，最終證實(shí)CTHRC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性是影響病人術(shù)后生存的危險(xiǎn)

6、因素。除比較原發(fā)腫瘤組織與腹膜轉(zhuǎn)移組織間差異表達(dá)基因外，還通過(guò)基因芯片技術(shù)比較了原發(fā)腫瘤組織和正常組織間的差異表達(dá)基因，并對(duì)部分基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。通過(guò)不同組織間差異表達(dá)基因的比較，有助于了解結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找理想的腹膜種植轉(zhuǎn)移標(biāo)記物，從而為早期發(fā)現(xiàn)、預(yù)防及治療結(jié)直腸癌的腹膜種植轉(zhuǎn)移提供可靠的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一章:回顧分析2003年1月～2008年12月南方醫(yī)院普外科收治的結(jié)直腸癌患

7、者的臨床病理資料，根據(jù)術(shù)中探查及術(shù)后病理結(jié)果，將病人分為腹膜轉(zhuǎn)移組和無(wú)轉(zhuǎn)移組。通過(guò)比較兩組病人間年齡、性別、腫瘤部位、大小、病理類(lèi)型、分化程度、T分期、N分期、術(shù)前癌胚抗原(CEA)、血清糖鏈抗原19-9(CA19-9)的差異，尋找結(jié)直腸癌腹膜種植轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。
　　 第二章:2010年4月到2010年12月在中國(guó)廣州南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院手術(shù)治療結(jié)直腸腺癌伴腹膜種植轉(zhuǎn)移病人4例，術(shù)中收集原發(fā)腫瘤組織和腹膜轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本，浸泡

8、于RNALater中常溫保存。應(yīng)用Trizol法提取總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后經(jīng)體外擴(kuò)增合成aRNA后用Cy3熒光分子標(biāo)記，標(biāo)記后與人類(lèi)全基因組表達(dá)譜芯片雜交，待芯片完全干燥后，利用掃描儀(LuxScan3.0，北京博奧)進(jìn)行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強(qiáng)度的數(shù)字信號(hào)(GenePixPro6.0)，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。采用倍數(shù)法（≥2或≤0.5）確定配對(duì)標(biāo)本間差異表達(dá)基因，通過(guò)DAVID(TheDatabaseforAn

9、notation，VisualizationandIntegratedDiscovery)分析工具對(duì)這組差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能的注釋和基因富集分析，篩選出與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的功能類(lèi)，在這些功能類(lèi)中挑選差異倍數(shù)較高且參與多個(gè)功能類(lèi)的基因進(jìn)行半定量熒光RT-PCR驗(yàn)證。
　　 第三章:收集2003年1月～2010年12月間廣州南方醫(yī)院普外科行手術(shù)治療的結(jié)直腸腺癌伴腹膜轉(zhuǎn)移病人的組織蠟塊，獲取正常組織蠟塊標(biāo)本40塊，腫瘤原發(fā)組織蠟塊標(biāo)本

10、66快，腹膜轉(zhuǎn)移組織蠟塊標(biāo)本42塊，另外從數(shù)據(jù)庫(kù)中選取5年隨訪期內(nèi)無(wú)腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生的病人原發(fā)腫瘤蠟塊標(biāo)本68塊，作為對(duì)照組。采用SP法檢測(cè)CTHRC1蛋白在不同組織標(biāo)本間表達(dá)水平的差異，一抗采用兔抗人CTHRC1多克隆抗體，購(gòu)于美國(guó)AbCam公司，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。CTHRC1蛋白主要分布于細(xì)胞膜及胞漿中，呈棕黃色顆粒，細(xì)胞核中不表達(dá)。在細(xì)胞膜及胞漿中有棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性，無(wú)棕黃色顆粒判定為陰性。
　　 第四章:201

11、0年4月到2010年12月間收集的結(jié)直腸癌伴腹膜種植轉(zhuǎn)移病人的手術(shù)標(biāo)本中，選取3例中分化腺癌病人的原發(fā)腫瘤組織和正常組織進(jìn)行下一步芯片實(shí)驗(yàn)，術(shù)中收集原發(fā)腫瘤組織和正常組織標(biāo)本，浸泡于RNALater中常溫保存，應(yīng)用Trizol法提取總mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后經(jīng)體外擴(kuò)增合成aRNA后用Cy3熒光分子標(biāo)記，標(biāo)記后與人類(lèi)全基因組表達(dá)譜芯片雜交，待芯片完全干燥后，利用掃描儀(LuxScan3.0，北京博奧)進(jìn)行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基

12、于熒光強(qiáng)度的數(shù)字信號(hào)(GenePixPro6.0)，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。采用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯法(P≤0.05)確定配對(duì)標(biāo)本間差異表達(dá)基因，通過(guò)GOTermFinder分析工具對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因本體論(geneontology，GO)分析，對(duì)部分差異表達(dá)基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及半定量熒光RT-PCR驗(yàn)證。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)或fisher確切概率法，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。對(duì)腹膜種植轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素分析采用

13、BinaryLogistic回歸分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，用log-rank法檢驗(yàn)，通過(guò)構(gòu)建Cox回歸模型，判定CTHRC1表達(dá)是否是影響術(shù)后病人生存的危險(xiǎn)因素。所有計(jì)算采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行，P值取雙尾，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 第一章:從數(shù)據(jù)庫(kù)中共選取符合上述要求病例共748例，其中，腹膜轉(zhuǎn)移組81例(10.8％)，無(wú)轉(zhuǎn)移組667例(89.2％)。單因素分析顯

14、示，腫瘤大小、腫瘤分化程度、腸壁浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前癌胚抗原(CEA)和血清糖鏈抗原19-9(CA19-9)水平與結(jié)直腸癌腹膜種植轉(zhuǎn)移有關(guān)。Logistic多因素回歸分析顯示，腸壁浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及術(shù)前癌胚抗原(CEA)和血清糖鏈抗原19-9(CA19-9)水平與結(jié)直腸癌腹膜種植轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 第二章:根據(jù)倍數(shù)法，在結(jié)直腸癌原發(fā)腫瘤組織和腹膜轉(zhuǎn)移組織中共篩選出差異表達(dá)基因217條，其中，在腹膜轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)上調(diào)90

15、條，表達(dá)下調(diào)127條。GO注釋分析分析發(fā)現(xiàn)在這217條差異表達(dá)基因中，有27條與分子功能相關(guān)，占25.71％;38條和生物學(xué)過(guò)程相關(guān)，占36.19％;40條和細(xì)胞組份有關(guān)，占38.1％，在分子功能中，84％與結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)，16％和催化活性相關(guān);在生物學(xué)過(guò)程中，27.94％與生物黏附相關(guān)，27.94％與細(xì)胞過(guò)程相關(guān)，5.88％與代謝過(guò)程相關(guān)，19.12％與結(jié)構(gòu)區(qū)域構(gòu)建相關(guān)，19.12％與結(jié)構(gòu)區(qū)域相關(guān);在細(xì)胞組分中，65.57％與細(xì)胞外

16、區(qū)域相關(guān)，34.43％與細(xì)胞外區(qū)域部分相關(guān)。通過(guò)功能聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要集中在細(xì)胞外區(qū)域及細(xì)胞間黏附等15個(gè)GOterms中。進(jìn)一步對(duì)90條表達(dá)上調(diào)基因進(jìn)行功能注釋富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有17個(gè)基因功能分類(lèi)Terms出現(xiàn)在富集分?jǐn)?shù)＞4的3個(gè)功能注釋簇中，其功能類(lèi)型涉及細(xì)胞間黏附、細(xì)胞外基質(zhì)連接、生物黏附等。在這17個(gè)功能類(lèi)中挑選人白細(xì)胞活化黏附因子(activatedleukocytecelladhesionmolecule，ALC

17、AM)、鈣黏附素11（Cadherin-11，CDH11）、基質(zhì)金屬蛋白酶-7（matrixmetallopeptidase7，MMP7）、組織金屬蛋白酶抑制劑1(tissuemetallopeptidaseinhibitor1，TIMP1)、膠原三股螺旋重復(fù)蛋白1（collagentriplehelixrepeatcontaining1，CTHRC1）這5條基因作為下一步研究方向。通過(guò)半定量熒光RT-PCR驗(yàn)證，無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果。

18、　　 第三章:腹膜轉(zhuǎn)移組病人正常組織CTHRC1陽(yáng)性表達(dá)率為20％，原發(fā)腫瘤組織中為68.2％，腹膜轉(zhuǎn)移組織中為85.7％，無(wú)腹膜轉(zhuǎn)移組病人CTHRC1陽(yáng)性表達(dá)率為22.1％。腹膜轉(zhuǎn)移組病人原發(fā)腫瘤組織(x2=23.127，P=0.000)及腹膜轉(zhuǎn)移組織(x2=35.580，P=0.000)CTHRC1表達(dá)水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且腹膜轉(zhuǎn)移組織中CTHRC1表達(dá)水平高于原發(fā)腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.208，P=

19、0.040)。另外腹膜轉(zhuǎn)移組病人原發(fā)腫瘤組織中CTHRC1表達(dá)水平高于無(wú)腹膜轉(zhuǎn)移組病人(x2=28.814，P=0.040)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存分析顯示CTHRC1表達(dá)陽(yáng)性組的累積總生存率(x2=18.689，P=0.000)及無(wú)病生存率(x2=17.057，P=0.000)低于CTHRC1表達(dá)陰性組，Cox回歸證實(shí)CTHRC1表達(dá)陽(yáng)性組患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)是CTHRC1表達(dá)陰性組患者的2.061倍，CTHRC1表達(dá)陽(yáng)性組患者術(shù)后復(fù)發(fā)和

20、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)是CTHRC1表達(dá)陰性組患者的1.946倍。
　　 第四章滿足P≤0.05的基因共有98個(gè)，相對(duì)于正常組織，在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)的基因有41個(gè)，腫瘤組織表達(dá)下調(diào)的基因有57個(gè)。通過(guò)向GOTERMFINDER服務(wù)器提交的是最后的98個(gè)差異表達(dá)基因符號(hào)列表，通過(guò)選擇FunctionOntology得出p≤0.01的GOterm，發(fā)現(xiàn)基因主要集中在proteinbinding(GO:0005515)這一功能類(lèi)中。從此功能類(lèi)中

21、挑選S100鈣結(jié)合蛋白P(S100calciumbindingproteinP,S100P)、抗氧化蛋白1(peroxiredoxin1，PRDX1)、分泌型白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(secretoryleukocytepeptidaseinhibitor,SLPI)。對(duì)三個(gè)基因采用GENEMANIA工具進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因在網(wǎng)絡(luò)中有共表達(dá)趨勢(shì)，SLPI在S100P和PRDX1中起到橋梁的作用。對(duì)這三條基因進(jìn)行半定量熒光RT-

22、PCR驗(yàn)證，無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果。
　　 結(jié)論:
　　 1.腫瘤浸潤(rùn)漿膜層、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CEA≥10ug/L及CA19-9≥74U/ml是結(jié)直腸癌腹膜種植轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。
　　 2.結(jié)直腸癌原發(fā)癌組織與腹膜轉(zhuǎn)移組織間存在大量差異表達(dá)基因，提示在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)轉(zhuǎn)移部位微環(huán)境的變化繼連續(xù)發(fā)生特有基因的集聚，對(duì)不同組織間基因表達(dá)差異的比較，有助于揭示結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制，為尋找生物學(xué)標(biāo)記及治療

23、靶向提供依據(jù)。
　　 3.在腹膜轉(zhuǎn)移組織中篩選出的ALCAM、CDH11、MMP7、TIMP1、CTHRC1這5條基因的表達(dá)上調(diào)與結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 4.結(jié)直腸腫瘤組織中存在著CTHRC1的高表達(dá)，并與腫瘤分化程度、侵潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 5.CTHRC1在結(jié)直腸癌腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并可能成為早期診斷的生物學(xué)標(biāo)記之一。
　　 6.CTHRC1表達(dá)強(qiáng)度和結(jié)直腸癌