結(jié)直腸癌候選抑癌基因ACVR1C的篩選和鑒定研究.pdf

1、研究目的：利用雜合缺失方法發(fā)現(xiàn)相關(guān)位點(diǎn)，對(duì)位點(diǎn)附近存在的基因進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)候選基因，并對(duì)其開(kāi)展驗(yàn)證可發(fā)現(xiàn)新的抑癌基因。本課題組前期采用雜合缺失掃描及精細(xì)定位候選克隆策略對(duì)中國(guó)人結(jié)直腸癌臨床標(biāo)本進(jìn)行全基因組掃描，本研究以此為基礎(chǔ)，針對(duì)1、2號(hào)染色體高頻雜合缺失區(qū)域開(kāi)展基因芯片掃描，篩選候選抑癌基因并對(duì)其開(kāi)展驗(yàn)證，希望發(fā)現(xiàn)新的結(jié)直腸癌相關(guān)抑癌基因。 方法：第一章以課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，針對(duì)1、2號(hào)染色體高頻雜合缺失區(qū)域開(kāi)展基因芯片

2、掃描，然后對(duì)篩選出的候選基因采用Real-time PCR進(jìn)行初步驗(yàn)證。第二章對(duì)芯片篩選出的ACVR1C進(jìn)行驗(yàn)證，首先擴(kuò)大組織樣本量檢測(cè)ACVR1C在結(jié)直腸癌及其對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)差異情況，然后構(gòu)建目的基因過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞，通過(guò)MTT檢測(cè)、細(xì)胞周期分析、凋亡檢測(cè)、平板克隆和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)研究ACVR1C對(duì)結(jié)腸癌惡性生物學(xué)行為的影響，最后開(kāi)展裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)平臺(tái)對(duì)ACVR1C的抑癌作用進(jìn)行驗(yàn)證。

3、 結(jié)果：1.基因芯片掃描發(fā)現(xiàn)CSRP1、PPP1R12B、LMOD1、CFHR3與ACVR1C5個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析以及Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，推測(cè)CSRP1基因和ACVR1C基因可能是與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的抑癌基因。2.針對(duì)ACVR1C基因擴(kuò)大樣本驗(yàn)證其在mRNA和蛋白水平的表達(dá)差異情況，結(jié)果顯示部分結(jié)直腸癌組織中ACVR1C的表達(dá)水平較正常組織降低或缺失。而后制備ACVR1C-wt與ACVRIC-ca過(guò)表達(dá)慢

4、病毒感染結(jié)腸癌RKO細(xì)胞，用于研究ACVR1C對(duì)結(jié)腸癌惡性生物學(xué)行為的影響。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ACVR1C基因后可抑制RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)細(xì)胞周期分析及凋亡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ACVR1C基因后G1期細(xì)胞比例及凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組升高。同時(shí)通過(guò)平板克隆和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ACVR1C對(duì)細(xì)胞體外成瘤能力的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ACVR1C后RKO細(xì)胞克隆數(shù)量少于空白細(xì)胞及空載體細(xì)胞，再次證實(shí)轉(zhuǎn)染ACVR1C后可抑制RKO細(xì)胞增殖能力。通過(guò)Tran

5、swell遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染ACVRIC的RKO細(xì)胞通過(guò)濾膜的數(shù)量明顯少于對(duì)照組。最后開(kāi)展裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)平臺(tái)對(duì)ACVR1C的抑癌作用進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染目的基因的RKO細(xì)胞成瘤體積及重量均明顯小于對(duì)照組。 結(jié)論：本研究通過(guò)基因芯片掃描及Real-time PCR篩選出結(jié)直腸癌候選抑癌基因ACVRIC，然后在體內(nèi)外多個(gè)平臺(tái)通過(guò)分子生物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)ACVR1C進(jìn)行驗(yàn)證，推測(cè)ACVRIC可能成為一新的結(jié)直腸癌相