結(jié)直腸癌hTERT調(diào)控相關(guān)miRNA的篩選與初步鑒定.pdf

1、結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是第三位常見惡性腫瘤，且發(fā)病率總體呈上升趨勢。臨床上CRC多是進(jìn)展期患者，雖聯(lián)合化療、靶向藥物治療、放療、外科手術(shù)等綜合治療手段，總體生存仍不滿意。CRC的發(fā)生發(fā)展與包括端粒酶等諸多腫瘤相關(guān)因子的異常表達(dá)及功能改變有關(guān)。深入研究這些腫瘤相關(guān)因子對(duì)了解CRC的發(fā)病機(jī)制、影響預(yù)后的因素及治療策略的選擇具有重要意義。
　　人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase rever

2、se transcriptase，hTERT)是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，特異地以hTR為模板，并將其轉(zhuǎn)錄為端粒DNA重復(fù)序列，是端粒酶復(fù)合物的催化亞基，是端粒酶活性調(diào)節(jié)的限速亞單位。研究發(fā)現(xiàn)，hTERT參與CRC的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移過程，與大腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及術(shù)后生存時(shí)間密切相關(guān)。因此了解hTERT在CRC中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制對(duì)于了解CRC的發(fā)病機(jī)制以及探尋特異性端粒酶抑制劑有重要意義，但目前hTERT轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍尚未清楚。

3、　　microRNA（miRNA）是一類真核生物中新發(fā)現(xiàn)的長度約為（18-24）nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。它通過抑制mRNA的翻譯或降解mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及腫瘤的發(fā)生中具有重要作用。目前僅發(fā)現(xiàn)3個(gè) miRNA(miR-138、miR-1266、miR-1207-5p)參與了hTERT在甲狀腺癌、胃癌中轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，而在大腸癌中還未曾有研究報(bào)道。由于miRNA對(duì)同一靶基因的調(diào)控在

4、不同類型的腫瘤中可能存在差異；另外miRNA對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)并非完全配對(duì)結(jié)合，一條miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因表達(dá)，而一個(gè)基因亦可同時(shí)受多條miRNA調(diào)控。我們推測在CRC中可能存在其他miRNA對(duì)hTERT的調(diào)控。本研究將分四部分，第一部分采用qRT-PCR技術(shù)檢測CRC組織中hTERT mRNA的表達(dá)情況，觀察hTERT mRNA與CRC臨床病理因素的關(guān)系；第二部分采用生物信息學(xué)技術(shù)，通過檢索基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫，獲得可能調(diào)控 hTER

5、T的候選miRNA；第三部分采用 qRT-PCR技術(shù)檢測候選miRNA在CRC組織中的表達(dá)情況，并觀察候選miRNA與CRC臨床病理因素的關(guān)系；第四部分采用western blot技術(shù)檢測CRC組織中hTERT蛋白表達(dá)情況，并分析可能調(diào)控 hTERT的miRNA與hTERT蛋白的相關(guān)性，為下一步印證和鑒定調(diào)控 hTERT的miRNA打下基礎(chǔ)。
　　第一部分 hTERT mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的：<

6、br>　　探討hTERT mRNA與CRC各臨床病理因素的關(guān)系以及在判斷CRC預(yù)后的意義。
　　方法：
　　采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測84例CRC組織中hTERT mRNA的表達(dá)，結(jié)合臨床參數(shù)及隨訪獲得的資料進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1.84例標(biāo)本中，20例hTERT在CRC組織中表達(dá)下

7、調(diào)（RQ<1），64例表達(dá)上調(diào)(RQ>1)，高表達(dá)率為76.19％。
　　2.與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中hTERT高表達(dá)率明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（92% vs52%，P=0.011）；與結(jié)直腸癌臨床 TNM分期Ⅰ/Ⅱ期相比，Ⅲ/Ⅳ期中hTERT高表達(dá)率明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（92.3% vs50%，P=0.006），但hTERT mRNA高表達(dá)水平與CRC患者的年齡、腫瘤的大小、分化程度、腫瘤

8、部位及浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間均無顯著性相關(guān)（P值均>0.05）。
　　3.結(jié)直腸癌患者h(yuǎn)TERT mRNA陽性組與陰性組之間總生存期生存曲線具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.014）。
　　結(jié)論：
　　hTERT mRNA在CRC組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，并與CRC患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后生存時(shí)間顯著相關(guān)，說明了hTERT在CRC發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。
　　第二部分 hTERT調(diào)控相關(guān)miRNAs的篩選

9、
　　目的：
　　基于表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)手段挖掘與結(jié)直腸癌hTERT調(diào)控相關(guān)的miRNAs。
　　方法：
　　根據(jù)設(shè)定條件在GeneExpressionOmnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫中下載與CRC相關(guān)的miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)GSE10259，GSE33127，GSE35602，GSE38389，GSE39845，GSE49246，GSE18392，GSE35982。結(jié)合文本挖掘及利用miRWa

10、lk在線軟件，初步篩選出hTERT調(diào)控相關(guān)的miRNA。
　　結(jié)果：
　　獲得了8個(gè)可能在大腸癌組織中表達(dá)下調(diào)且與hTERT調(diào)控相關(guān)的miRNA：miR-124、miR-138、miR-150、miR-378、miR-133a、miR-133b、miR-29c、miR-422a。
　　結(jié)論：
　　通過文本挖掘及miRWalk在線軟件可以初步篩選出高度可能hTERT調(diào)控相關(guān)的miRNA。
　　第三部分 hTE

11、RT調(diào)控相關(guān)的microRNAs在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的：
　　探討hTERT調(diào)控可能相關(guān)的miRNA在結(jié)直腸癌及相應(yīng)正常組織中的表達(dá)情況，分析其臨床意義。
　　方法：
　　采用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測84例結(jié)直腸癌組織中8個(gè)miRNA的表達(dá)，并結(jié)合臨床參數(shù)及隨訪獲得的資料進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　1. miRNA-29c-3p在大腸癌組和相應(yīng)正常組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

12、義（P=0.260），而miR-133a-3p，miR-133b，miR-422a，miR-150-5p，miR-378a-3p，miR-124-3p，miR-138-5p在結(jié)直腸癌組中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2. miR-133a-3p、miR-133b、miR-150-5p、miR-150-5p、miR-124-3p的低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、浸潤深度、淋巴

13、結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌相比，miR-138-5p在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌的低表達(dá)率更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（88.89% vs40.91%，P<0.000）；miR-138-5p的低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4.與無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌相比，miR-378a-

14、3p在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌的低表達(dá)率更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（77.78% vs.42.42%，P=0.008）；與結(jié)腸癌組相比，直腸癌組miR-378a-3p低表達(dá)率明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（66.67%vs.37.5%，P=0.008）。miR-378a-3p的低表達(dá)與CRC患者的年齡、性別、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　5.與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌相比，miR-42

15、2a在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性結(jié)直腸癌組的低表達(dá)率明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（59.26%vs.33.33%，P=0.023）；miR-422a的低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤位置、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　7個(gè)miRNA（miR-124-3p，miR-133a-3p，miR-133b，miR-138-5p，miR-150-5p，miR-378a-3p，mi

16、R-422a）在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，其中miR-378a-3p、miR-138-5p、miR-422a的表達(dá)下調(diào)與結(jié)直腸癌患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，miR-422a的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者總生存時(shí)間密切相關(guān)。
　　第四部分 miRNAs與hTERT蛋白表達(dá)的相關(guān)性研究
　　目的：
　　探討上述miRNA與hTERT蛋白表達(dá)的相關(guān)性，為下一步進(jìn)行可能靶向調(diào)控hTERT的miRNA的相關(guān)功能驗(yàn)證研究打下基礎(chǔ)。

17、r>　　方法：
　　采用 Western blot技術(shù)檢測 hTERT蛋白表達(dá)，結(jié)合第三部分7個(gè)miRNA的qRT-PCR檢測結(jié)果，進(jìn)行相關(guān)分析。
　　結(jié)果：
　　1.62例（注：原84例，實(shí)驗(yàn)過程中部分標(biāo)本丟失）結(jié)直腸癌患者h(yuǎn)TERT、miR-422a、miR-378a-3p、miR-150-5p、miR-138-5p、miR-133b、miR-133a-3p、miR-124-3p高表達(dá)組與低表達(dá)組總生存期生存曲線之

18、間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.272，P=0.062，P=0.130，P=0.707，P=0.174，P=0.845，P=0.575，P=0.127）。但miR-422a、miR-150-5p、miR-124-3p、miR-138-5p在高表達(dá)組與低表達(dá)組之間的生存曲線分開相當(dāng)明顯。
　　2. miR-124-3p、miR-150-5p的表達(dá)與其他5個(gè)miRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，與hTERT蛋白表達(dá)無顯著相關(guān)性（r詳見論文第四部分）；m

19、iR-133a-3p的表達(dá)與miR-138-5p的表達(dá)、hTERT蛋白表達(dá)無顯著相關(guān)性，而與其余5個(gè)miRNA的表達(dá)呈正相關(guān)（r詳見論文第四部分）； miR-138-5p與miR-133a-3p的表達(dá)無顯著相關(guān)性，而其他5個(gè)miRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，與hTERT蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r詳見論文第四部分）。miR-133b、miR-378a-3p、miR-422a的表達(dá)分別與其他6個(gè) miRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，與hTERT蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r