MiRNA-300對結直腸癌腫瘤侵襲和增殖的影響及其調控機制的初步研究.pdf

1、背景及目的：
　　結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是人體非常常見的惡性腫瘤，其中又分為結腸癌和直腸癌。結直腸癌根據發(fā)病部位其發(fā)病率有很大的不同，從高到低依次為直腸、乙狀結腸、盲腸、升結腸、降結腸及橫結腸，近年有向近端（右半結腸）發(fā)展的趨勢。其發(fā)病與生活方式、遺傳、大腸腺瘤等各方面關系密切。近幾年研究發(fā)現，除了少部分結直腸癌患者有著明顯的家族性發(fā)病傾向以外，絕大多數的患者屬于散發(fā)性結直腸癌患者，發(fā)病的原因多與個

2、體基因突變有關，其中包括有染色體突變、DNA錯配修復等等不同的類型，目前關于結直腸癌的發(fā)病機制研究并沒有十分透徹，其發(fā)病途徑大體可分為三類，但其中每種途徑的具體分子機制還有待進一步的研究。
　　除了原發(fā)病灶以外，結直腸癌的浸潤轉移也是危害人體健康的重要因素。結直腸癌最常見的浸潤形式是局部侵犯，腫瘤通過種植轉移逐步浸潤周圍組織或器官，造成相應的臨床癥狀?；颊咭坏┏霈F肛門失禁、下腹及腰骶部持續(xù)疼痛，則是直腸癌侵及骶神經叢所致。腫瘤細胞

3、種植轉移到腹腔、盆腔，形成相應的癥狀和體征，直腸指檢可在膀胱直腸窩或子宮直腸窩內捫及塊物，腫瘤在腹盆腔內廣泛種植轉移，形成腹腔積液。結直腸癌的遠處轉移主要有兩種方式：淋巴轉移和血行轉移。腫瘤細胞通過淋巴管轉移至淋巴結，也可通過血行轉移至肝臟、肺部、骨等部位。目前來講，結直腸癌最常見的遠處轉移是結直腸癌肝轉移，這也是危害最大的途徑，約50％的患者會出現術前或者術后的結直腸癌肝轉移，其中，又有30%的病人在手術前已經有 B超或者CT無法檢測

4、到的隱匿性肝轉移。結直腸癌肝轉移灶采取切除術是比較安全的，也是目前提高已經發(fā)生結直腸癌肝轉移的患者的最優(yōu)治療方案，但遺憾的是，只有10%-20%的結直腸癌肝轉移患者適合手術切除治療，且其中70%的病人會出現病后復發(fā)。
　　作為一種多基因突變導致的惡性癌癥，結直腸癌有著非常復雜的發(fā)病機制，目前為止，人們已經發(fā)現有幾種信號轉導通路與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展有著極其密切的聯系，其中包括Wnt/β-catenin途徑、Ras途徑、p53途徑等等

5、，而在這些途徑中，p53途徑作為最經典的抑癌基因，被人們研究的也最多，但是經臨床研究發(fā)現，那些因為p53變異而導致結直腸癌的患者對于目前的治療手段有著明顯的抵抗力，而且即使通過相應治療得到好轉，其預后也相對較差。雖然其機制還并不是十分清楚，但是并不妨礙人們將p53作為試圖研究結直腸癌的突破口。
　　所有腫瘤組織細胞中，p53異常的數量超過了50%，在最初的發(fā)現中，p53是作為一個抑癌基因所出現，在細胞增殖生長周期中，p53起著極其

6、重要的調控作用，它可以暫時性的暫停細胞周期的進程，以給與損傷DNA修復的時間，也可以誘導細胞凋亡，防止細胞無限制增長現象的出現，還可以永久的終結一些不停進行細胞分裂的癌變細胞。可以了解到，一個人體內細胞如果出現癌變，細胞中功能正常的p53就會立即停止該癌變細胞的分裂分化，而一旦人體內癌癥細胞中的p53出現異常，就會導致該細胞無限制的繁殖，出現整個組織的癌變。在1989年報道中，第一次發(fā)現結直腸癌細胞中的p53出現了突變，至今已經有超過8

7、00篇文獻研究過這個問題，其中就有報道稱，在體內，野生型的p53可以抑制結直腸癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　MicroRNA（MiRNA）是一種有內源基因編碼的、長度大概為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在動植物體內廣泛存在，主要參與了生物體內基因表達調控作用，目前為止，文獻報道過的人類已經發(fā)現的RNA分子個數為28645個。MicroRNA（MiRNA）是屬于小RNA的一種，在組織細胞中起著極其重要的調控作用，每個MiRNA都有自

8、己特定的靶基因，通常可以一個MiRNA調控多個基因，也可以幾個MiRNA調控同一個基因，從而在人體內形成了一個復雜的基因調控網絡。
　　結直腸癌細胞中存在著MiRNA異常表達的研究起始于2003年，Michael等報道，與正常粘膜組織對比，結直腸癌腺瘤和腺瘤階段的組織中都存在著MiRNA-143的表達恒定下調。目前研究已經肯定多種MiRNA的異常表達與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程密切相關，有些MiRNA分子在發(fā)病過程中起著致癌基因的作用

9、，如MiRNA-21、MiRNA-17-92等在結直腸癌細胞中表達明顯增高，并分別通過抑制靶基因PDCD4、SPRY2和E2F1等的表達促進腫瘤的發(fā)展，另一些MiRNA分子則起著抑癌基因的作用并在結直腸癌細胞中的表達下調，如MiRNA-143、MiRNA-145和MiRNA-200等，這些MiRNA對靶基因的K-ras、ERK5和ZEB1等表達的抑制減弱在結直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　MiRNA-300是一個高度保守的M

10、iRNA，最初被認為是一個特異性的調控造血祖細胞增殖及粒系分化的MiRNA。目前對MiRNA-300的表達研究在血液性疾病中較多，例如，在急性粒細胞白血病中，MiRNA-300的表達明顯下調；MiRNA-300在慢性淋巴細胞性白血病中表達下調；MiRNA-300調控粒細胞的增殖和分化；在髓外細胞瘤中MiRNA-300的表達缺失。此外，研究還發(fā)現，MiRNA-300在肝細胞癌、原發(fā)性的小細胞性肺癌中表達下調；而在食管鱗狀細胞癌、肝內膽管細

11、胞癌、膀胱癌及胃癌中表達上調。由此可見，MiRNA-300與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展可能存在一定的聯系。
　　由于MiRNA-300是一類新發(fā)現的MiRNA，所以目前對其研究較少，之前的文獻對于MiRNA-300與腫瘤的關系的報道更多的集中在血液病中，且對于其分子機制并沒有進行深入的研究，本研究的主要目的是通過發(fā)現MiRNA-300在結直腸癌細胞中表達水平的變化，并對其進行深入的研究，來探究MiRNA-300在結直腸癌中的作用機理。

12、>　　主要擬解決的問題是：1，在結直腸癌組織細胞中以及結直腸癌細胞系中，是否存在MiRNA-300表達水平的改變；2，MiRNA-300對結直腸癌細胞是否有著明顯的作用；3，通過把經過MiRNA-300轉染的結直腸癌細胞植入裸鼠，研究MiRNA-300對在體腫瘤生長的影響；4，MiRNA-300導致腫瘤異常增殖和侵襲的分子機制。
　　方法：
　　1、結直腸癌中的異常表達 miRNAs篩選及驗證，采用組織芯片初步篩選技術在結直

13、腸癌組織中探測表達明顯改變的MiRNA。利用熒光定量驗證在結直腸癌組織和結直腸癌細胞系中的MiRNA表達水平。并通過Western blot及數理統計研究MiRNA-300在不同結直腸癌細胞系中的表達分布。
　　2、通過病毒轉染，研究MiRNA-300對結直腸癌細胞系增殖和侵襲能力的影響。分別是通過細胞成團實驗來研究結直腸癌細胞系增值能力的變化，以及利用細胞侵襲實驗來研究MiRNA-300含量的提高對細胞侵襲能力的影響。
　

14、　3、通過將MiRNA-300轉染的結直腸癌細胞系和未經過MiRNA-300轉染的結直腸癌細胞系分別注入裸鼠皮下，研究MiRNA-300對結直腸癌細胞系在裸鼠體內成瘤能力的影響。
　　4、通過基因篩選選擇MiRNA-300潛在靶基因，并通過Western Blot以及熒光素酶實驗驗證MiRNA-300與p53之間的聯系。
　　結果：
　　1、通過對結直腸癌組織芯片和結直腸癌細胞系中MiRNA-300表達水平的測量，發(fā)現

15、在原發(fā)性結直腸癌、淋巴轉移及遠處轉移的結直腸癌中MiRNA-300的表達水平明顯高于正常組織細胞。相較于正常癌旁組織，原發(fā)性結直腸癌組織細胞中MiRNA-300含量高約27%：而在淋巴轉移及遠處轉移結直腸癌細胞中，相較于正常癌旁組織，MiRNA-300含量提高約18%及19%。在結直腸癌細胞系中，Sw620比正常黏膜組織細胞系中MiRNA-300含量高約41%，Caco2及 HT29細胞系相較正常黏膜組織細胞系MiRNA-300提高約2

16、0%及24%。該統計結果具有顯著性差異，p<0.05。
　　2、經過MiRNA-300轉染的結直腸癌細胞與未經過轉染的結直腸癌細胞相比，細胞侵襲力和細胞活性明顯增強。在細胞活性的檢測中，經過MiRNA-300轉染后的結直腸癌細胞系比未經過MiRNA-300轉染的結直腸癌細胞系細胞活性高23%；在細胞成團實驗中，經過轉染的結直腸癌系聚集成團現象明顯多于未經過轉染的結直腸癌細胞系，經過細胞計數，成團細胞高約70%；在48小時細胞侵襲實

17、驗中，經過轉染的結直腸癌細胞系侵襲距離大概為未經過轉染的結直腸癌細胞系侵襲距離的2倍。
　　3、在裸鼠體內經過MiRNA-300轉染的結直腸癌細胞比未經過轉染的結直腸癌細胞成瘤能力明顯增強。分別測量二者的體積和重量后得知，經過MiRNA-300轉染的結直腸癌細胞系的平均成瘤體積為1130mm3，平均重量為0.8g；而在未經過轉染的結直腸癌細胞系中，平均成瘤體積為840mm3，平均重量為0.46g；體積增長約為35%，而重量增長約為

18、74%。該統計具有顯著性差異，p<0.05。
　　4、通過檢測發(fā)現MiRNA-300與p53有著明顯的協同作用，MiRNA-300的上調及下調分別導致了p53含量的升高及降低；之后又發(fā)現MiRNA-300與p53的3’-UTR有著明顯的熒光共定位現象，由此我們可以推斷p53正是3’-UTR的下游調控靶基因。
　　結論：
　　1、在原發(fā)性結直腸癌細胞中MiRNA-300含量相較于整腸黏膜組織細胞有所提高，而在淋巴轉移和遠

19、處轉移的結直腸癌組織中MiRNA-300的含量也有所提升。而在分別代表三種不同類型的細胞系中我們驗證了相同的結果。
　　2、經MiRNA-300轉染后的結直腸癌細胞系細胞活性增強及細胞聚集成團能力顯著提升；經過MiRNA-300轉染后的結直腸癌細胞系與正常結直腸癌細胞系相比，細胞侵襲距離顯著提高。
　　3、經過MiRNA-300轉染后的結直腸癌細胞系與未經過MiRNA-300轉染的結直腸癌細胞系相比，成瘤體積及成瘤重量都有著

20、顯著的提升，這代表MiRNA-300對結直腸癌細胞系的成瘤能力有著明顯的促進作用，也就進一步證實了MiRNA-300對結直腸癌增值能力有著明顯的促進作用。
　　4、MiRNA-300的上調及下調分別導致了p53含量的升高及降低，表明了MiRNA-300與p53有著明顯的聯系，而p53含量的提升與降低也影響著MiRNA-300的表達，二者之間的關系極其密切，MiRNA-300與p53的3’-UTR緊密相接，這就證實了二者在結直腸癌細