Annexin A4對(duì)結(jié)直腸癌EMT及侵襲轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的:結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是一種較為常見的消化道惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的發(fā)病是一個(gè)牽涉到多基因、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，因此其具體的發(fā)病機(jī)制仍不明確。膜聯(lián)蛋白(Annexins，ANX)家族是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白的超家族。該家族不僅參與胞吞、胞吐、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞骨架構(gòu)成等生理活動(dòng)，而且在多種腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥中也發(fā)揮了重要作用。Annexin A4是該家族里的一

2、員，近年來(lái)的研究顯示，膜聯(lián)蛋白A4(Annexin A4，ANXAⅣ，ANXA4)的表達(dá)失調(diào)、定位改變均與腫瘤密切相關(guān)，并可能與腫瘤的侵襲遷移有關(guān)，但其涉及的具體分子機(jī)制尚未清楚。本課題擬通過(guò)siRNA干擾技術(shù)沉默結(jié)直腸癌細(xì)胞中Annexin A4的表達(dá)，探討Annexin A4對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)分子的表達(dá)以及對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響，

3、進(jìn)一步豐富Annexin A4在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的分子機(jī)制。
　　方法:通過(guò)qRT-PCR法和Westem blot免疫印跡法檢測(cè)三種結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW480、 SW620、HT-29）中Annexin A4以及EMT相關(guān)的關(guān)鍵分子的表達(dá)情況，分析Annexin A4表達(dá)水平與結(jié)直腸癌EMT的關(guān)系，并篩選出適合本實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞系HT-29;采用siRNA技術(shù)干擾結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中Annexin A4的表達(dá)后再通過(guò)qRT

4、-PCR法和 Westem blot免疫印跡法檢測(cè)Annexin A4以及部分EMT相關(guān)重要分子（如:E-caderin、N-caderin等）表達(dá)水平的變化;采用siRNA技術(shù)干擾結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中Annexin A4的表達(dá)后，再通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞的增殖情況的變化，Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞體外侵襲能力的改變，劃痕試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞體外遷移能力的改變。

5、r>　　結(jié)果:1.qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示Annexin A4 mRNA在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460中表達(dá)很低，而在結(jié)直腸癌SW620、SW480、HT29細(xì)胞株中Annexin A4 mRNA表達(dá)水平明顯增高，尤其以結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞最為明顯;
　　2.Western Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞株Annexin A4的表達(dá)水平相對(duì)于結(jié)直腸癌SW620、SW480細(xì)胞株表達(dá)最高，這與qRT-PCR法檢測(cè)的

6、結(jié)果一致;
　　3.qRT-PCR法和Western Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞系上皮表型標(biāo)志分子E-caderin分子表達(dá)明顯低于其他結(jié)直腸癌SW620、SW480細(xì)胞株，而間質(zhì)表型特異性分子N-caderin分子表達(dá)明顯高于結(jié)直腸癌SW620、SW480細(xì)胞系;
　　4.siRNA技術(shù)干擾結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞的Annexin A4表達(dá)后，qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示siA4組結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞內(nèi)N-ca

7、ndherin、MMP9、MMP2、ZEB1、Snail、Slug和Vimentin表達(dá)水平低于siNC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而E-candherin的表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);
　　5.siRNA技術(shù)干擾結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞的Annexin A4表達(dá)后，WesternBlot法檢測(cè)結(jié)果顯示siA4組結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達(dá)水平明顯高于siN

8、C組，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-caderin的蛋白水平明顯降低;
　　6.siRNA技術(shù)干擾結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞的Annexin A4表達(dá)后，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示siA4組結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞增殖速度較siNC組明顯降低((P＜0.01)，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示siA4組細(xì)胞克隆形成數(shù)較siNC組明顯減少(P＜0.001)。
　　7.siRNA技術(shù)干擾結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞的Annexin A4表達(dá)后，Transwell