轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的早期診斷.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一，位居歐美發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病和死因的第二和第三。近二十余年來(lái)，隨著我國(guó)居民生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。目前，結(jié)直腸癌的手術(shù)療效已有所改觀(guān)，而復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是臨床醫(yī)師面臨的主要難題。在分期較早的病人中，可能存在未被常規(guī)病理形態(tài)學(xué)或臨床檢查所發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移。因此，從分子水平對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移早期發(fā)現(xiàn)和診斷是提高術(shù)后生存率的關(guān)鍵所在。 本研究針對(duì)石蠟包埋組織R

2、NA的提取方法進(jìn)行了研發(fā)，并建立了一種可應(yīng)用于臨床的提取方法；針對(duì)RNA定量的需要，建立了可直接用于RT—PCR的定量參考品；采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量RT—PCR(qRT—PCR)方法對(duì)鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C(guanylyl cyclase C，GCC) mRNA在結(jié)直腸癌組織、配對(duì)正常粘膜及淋巴結(jié)中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析GCC基因mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，建立了一種可以用于結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)記物檢測(cè)方法。 第一部分石蠟

3、包埋組織中總RNA的提取和純化 目的：建立一種從福爾馬林固定、石蠟包埋組織提取和純化總RNA的簡(jiǎn)便、快速的方法。 方法：從廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心病理科收集石蠟包埋標(biāo)本20例，其中2008年新鮮包埋的標(biāo)本有6例，2006年和2007年包埋標(biāo)本各5例，2005年包埋標(biāo)本7例，這些標(biāo)本涉及到了子宮肌瘤，闌尾炎，大腸癌，胰腺炎，肝癌等。每例標(biāo)本均切取5張10μm厚切片，運(yùn)用硅膠模—離心柱法從石蠟包埋組織中提取RNA，以經(jīng)典的AGP

4、C(酸—異硫氰酸胍—苯酚—氯仿法，acid guanidium thiocyanate—phenol chloroform extraction，AGPC)法做對(duì)照。提取總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度，瓊脂糖凝膠電泳和管家基因TBP檢測(cè)所提RNA的質(zhì)量。 結(jié)果：20例石蠟包埋組織中提取的總RNA經(jīng)過(guò)紫外分光光度儀測(cè)定后，260nm與280nm光密度比在1.8～2.0；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，部分樣本可以看到預(yù)期的目的條帶。經(jīng)過(guò)熒

5、光定量RT—PCR檢測(cè)，所有樣本提取的RNA都能擴(kuò)增出TBP片段。 結(jié)論：硅膠模—離心柱法提取石蠟包埋組織中的RNA簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速，可用于臨床研究。 第二部分 GCC定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備 目的：應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄的方法，制備定量GCC mRNA的標(biāo)準(zhǔn)品，用于熒光定量RT—PCR檢測(cè)。 方法：提取結(jié)直腸癌組織總RNA，RT—PCR擴(kuò)增后用PMD-18T載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄的方法，即用帶有T7啟動(dòng)子序列

6、和PolyT序列的引物對(duì)目的基因和內(nèi)參照進(jìn)行PCR，克隆入PMD-18T載體進(jìn)行體外合成GCC和TBP的cRNA模板。合成的cRNA定量和稀釋后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR，即可得到cRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 結(jié)果：cRNA定量的線(xiàn)性范圍達(dá)5個(gè)數(shù)量級(jí)，相關(guān)系數(shù)為0.99。 結(jié)論：成功制備了定量GCC的標(biāo)準(zhǔn)品，可應(yīng)用于熒光定量RT—PCR定量檢測(cè)。 第三部分 GCC在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中的表達(dá)研究 目的：研究鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C

7、(GCC mRNA)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)并探討其意義。 方法：提取57例結(jié)直腸癌腫瘤組織、癌旁正常組織以及癌旁淋巴結(jié)中總mRNA，應(yīng)用熒光定量RT—PCR的方法檢測(cè)GCC表達(dá)情況。利用第二部分構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品采用絕對(duì)定量的方法分析結(jié)果，最后應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1.GCC在正常結(jié)直腸組織及結(jié)直腸癌組織中均有表達(dá)，但在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯較正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)強(qiáng)(P<0.05)，且其表達(dá)的強(qiáng)弱與

8、腫瘤的分期和解剖部位無(wú)關(guān)。 2.在結(jié)直腸癌患者中，28例病理診斷陽(yáng)性的淋巴結(jié)中27例檢出GCCmRNA，陽(yáng)性檢出率為96.43％(27/28)，29例常規(guī)病理陰性病例中5例檢測(cè)到GCCmRNA的表達(dá)。 結(jié)論： 1.GCC在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的分期和解剖部位無(wú)關(guān)。 2.GCC在結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)中的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，GCCmRNA表達(dá)對(duì)于臨床診斷結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移具有重要意義。

9、 3.熒光定量RT—PCR法檢測(cè)GCC mRNA表達(dá)快速，準(zhǔn)確，可以提高淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢出率。 小結(jié)： 1.硅膠膜—離心柱法提取石蠟包埋組織中的RNA簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速，可用于臨床研究。 2.制備定量GCC的標(biāo)準(zhǔn)品，可應(yīng)用于熒光定量RT—PCR定量檢測(cè)。 3.GCC在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的分期和解剖部位無(wú)關(guān)。 4.GCC在結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)中的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，GCC mRN