下調(diào)HOTAIR表達(dá)對結(jié)直腸癌及其癌干細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響.pdf

1、結(jié)直腸癌起源于粘膜上皮或粘膜下間葉組織，是由結(jié)直腸粘膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡變，是最常見的消化道惡性腫瘤之一。在各類惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌的發(fā)病率居第三位，占胃腸道腫瘤的第二位。結(jié)直腸癌治療以手術(shù)、放化療為主，因其極易侵犯血管、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處而增加了根治的難度。結(jié)直腸癌是上皮源性的腫瘤，上皮細(xì)胞之所以惡性病變進(jìn)而轉(zhuǎn)移，可能涉及到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition

2、，EMT)。
　　近年來，非編碼RNA作為表觀遺傳學(xué)研究內(nèi)容之一，從小RNA到長鏈非編碼RNA(LncRNA)，在腫瘤中已被廣泛探究。HOX transcript antisense RNA(HOTAIR)作為LncRNA大家族的成員之一，在乳腺癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中已有較多的研究報(bào)道。盡管如此，HOTAIR在結(jié)直腸癌及其癌干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)中的分子生物學(xué)特性仍知之甚少。本研究選擇

3、人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞系作為研究對象，針對HOTAIR編碼基因設(shè)計(jì)合成小發(fā)夾RNA（small hairpin RNA），利用RNAi的方法，將構(gòu)建好的真核ShRNA表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至LoVo細(xì)胞，來降低HOTAIR表達(dá)水平，并分選出結(jié)直腸癌CSCs，通過檢測細(xì)胞生物學(xué)特性改變，探討HOTAIR是否可作為結(jié)直腸癌CSCs治療的新靶點(diǎn)。
　　目的:
　　探討抑制結(jié)人結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞及其CSCs中HOTAIR的表達(dá)，

4、對癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響，為進(jìn)行以HOTAIR為靶點(diǎn)的結(jié)直腸癌治療提供依據(jù)。
　　方法:
　　以Superior-EGFP1為載體構(gòu)建的ShRNA重組質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，經(jīng)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后，用QRT-PCR檢測HOTAIR的表達(dá)。通過LoVo細(xì)胞體外增殖能力、耐藥能力、克隆形成能力、轉(zhuǎn)移侵襲能力、體內(nèi)致瘤性等實(shí)驗(yàn)，綜合分析下調(diào)HOTAIR表達(dá)后對LoVo細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。進(jìn)而，通過

5、免疫磁珠分選出結(jié)直腸癌CSCs，用上述方法及免疫組化和Western Blot方法對其侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子表達(dá)做進(jìn)一步分析。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR檢測證實(shí)在結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo中存在HOTAIR的表達(dá);結(jié)直腸癌CSCs高表達(dá)HOTAIR，與LoVo細(xì)胞相比，差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　2.構(gòu)建的真核重組表達(dá)載體經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，經(jīng)G418成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)

6、的細(xì)胞株。QRT-PCR檢測結(jié)果表明，構(gòu)建的HOTAIR-ShRNA對HOTAIR的表達(dá)有一定的抑制作用。
　　3.通過劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、體外增殖實(shí)驗(yàn)、耐藥實(shí)驗(yàn)和致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，HOTAIR-ShRNA轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞，其遷移與侵襲性、體外增殖能力、耐藥性、克隆形成能力以及在裸鼠體內(nèi)的致瘤性均有所下降，與Scramble-ShRNA轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞及野生型細(xì)胞相比，差異有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.

7、01）。此外，Western Blot證明，下調(diào)HOTAIR后可增加細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)，降低波形蛋白的表達(dá)。
　　4.經(jīng)免疫磁珠分選出CD133陽性的結(jié)直腸癌CSCs，轉(zhuǎn)染HOTAIR-ShRNA后，與野生型及Scramble-ShRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CSCs相比，細(xì)胞的遷移與侵襲性、體外增殖能力、耐藥性、克隆形成能力以及在小鼠的致瘤性有明顯所下降，差異有顯著性意義（P＜0.05或P＜0.01）。免疫組化和Western Blot

8、分析結(jié)果同時證明，轉(zhuǎn)染HOTAIR-ShRNA的結(jié)直腸癌CSCs，所致的裸鼠腫瘤及肺組織中EMT相關(guān)分子表達(dá)發(fā)生改變，即E-鈣黏蛋白表達(dá)升高，波形蛋白表達(dá)降低，與Scramble-ShRNA轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞及野生型細(xì)胞所致的裸鼠腫瘤及肺組織組相比，差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.降低人結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)，可在一定程度上降低LoVo細(xì)胞在體外的克隆形成能力、增殖能力、耐藥性、侵襲