結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因Tiam1功能的初步研究.pdf

1、研究背景和目的 結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近十年來，結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。轉(zhuǎn)移是影響患者治療效果和死亡的主要原因，探討與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素，尋找預(yù)防和治療的有效途徑，是當(dāng)代腫瘤學(xué)研究的一項迫切任務(wù)。 在我們的前期研究中，利用自行研制的含有447個已知腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因cDNA芯片，篩選出51個結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。應(yīng)用文獻(xiàn)輪廓挖掘微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)方法，篩選出4個與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的新

2、基因，并對其中一個新的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1(Tlymphomainvasionandmetastasis,Tiam1),在RNA水平進(jìn)行了初步驗證。 Tiaml是鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子(guaninenucleotideexchangefactors,GEFs)家族成員，GEFs的主要功能是調(diào)節(jié)RhoGTPase的活性。RhoGTPase家族包括Rho、Rac及Cdc42，是Ras超家族的成員。Tiaml體內(nèi)

3、外均可以特異性地激活RhoGTPase家族中的Racl。新近的研究發(fā)現(xiàn)Tiam1不但激活Rac，更重要的是Tiam1直接與胞漿和胞膜上的蛋白質(zhì)相互作用，將它們耦合到Tiam1-Rac信號通路上，從而影響Rac信號通路的特異性。 本研究重點(diǎn)探討Tiam1基因?qū)Y(jié)直腸癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響和作用機(jī)制，闡明Tiam1在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的主要生物學(xué)功能，為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的早期診斷和治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 1.結(jié)直腸癌組織

4、中Tiam1的表達(dá)及臨床意義 應(yīng)用免疫組化S-P法，檢測157例結(jié)直腸癌和配對的30例正常結(jié)直腸黏膜、35例結(jié)直腸癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌以及32例結(jié)直腸腺瘤組織中Tiam1蛋白的表達(dá)。 2.Tiam1過表達(dá)對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 用RT-PCR方法檢測Tiam1基因在9種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，篩選Tiam1不表達(dá)的細(xì)胞株；將Tiam1/C1199HAcDNA導(dǎo)入內(nèi)源性不表達(dá)Tiam1基因的人結(jié)直腸癌HT29

5、細(xì)胞株中，G418篩選抗性單克隆，RT-PCR、免疫組化及Westernblot鑒定轉(zhuǎn)染后Tiam1基因在細(xì)胞中的表達(dá)；觀察Tiam1基因轉(zhuǎn)染前后，細(xì)胞增殖、體外侵襲、成瘤能力及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的變化。 3.建立整體可視化結(jié)腸癌原位及轉(zhuǎn)移動物模型 利用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將pEGFP-N1質(zhì)粒導(dǎo)入人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，獲得穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescent

6、protein,EGFP)的細(xì)胞株SW480/EGFP+；通過結(jié)腸癌原位手術(shù)移植的方法建立結(jié)腸癌原位及轉(zhuǎn)移模型，利用腫瘤細(xì)胞表達(dá)EGFP的特點(diǎn)，借助整體熒光體視鏡結(jié)合IPP5.0軟件采集、分析EGFP發(fā)出的熒光信號，在動物活體實時觀察結(jié)腸癌局部成瘤及轉(zhuǎn)移情況；利用MTT法檢測和分析EGFP對細(xì)胞增殖能力的影響；應(yīng)用病理學(xué)方法對結(jié)腸癌原位及轉(zhuǎn)移動物模型進(jìn)行評價和鑒定。 4.Tiam1表達(dá)沉默對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

7、設(shè)計Tiam1干擾片段，構(gòu)建含U6啟動子的慢病毒載體，將慢病毒載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT病毒包裝細(xì)胞，收集病毒上清，進(jìn)行病毒滴度測定，用慢病毒感染結(jié)直腸癌細(xì)胞，用RT-PCR和Westernblot鑒定有效的干擾載體。 5.利用基因芯片和比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析Tiam1在結(jié)直腸癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用 利用Affymetrix公司的寡核苷酸芯片(47,400個轉(zhuǎn)錄本，包含38,500個已知基因)檢測Tiam1基

8、因表達(dá)沉默后差異基因表達(dá)譜。應(yīng)用GeneOntology、MILANO、Panther、Genomatix等軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 結(jié)果 1.結(jié)直腸癌組織中Tiam1蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示Tiam1在正常結(jié)直腸黏膜、腺瘤、癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌四種類型的組織中表達(dá)明顯不同，差異具有顯著性(χ2=23.561，P＜0.01)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，腺瘤Tiam1表達(dá)比正常結(jié)直腸黏膜組織強(qiáng)(Z=-2.423，P＜0.05)

9、，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織Tiam1表達(dá)比結(jié)直腸癌組織強(qiáng)(Z=-2.051，P＜0.05)，而結(jié)直腸癌組織與腺瘤組織Tiam1表達(dá)差異無顯著性(Z=-0.938，P＞0.05)。在結(jié)直腸癌組織中，伴發(fā)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織比未發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌組織Tiam1表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異具有顯著性(Z=-3.176，P＜0.01)。研究結(jié)果提示，Tiam1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，即Tiam1表達(dá)弱或陰性者轉(zhuǎn)移的發(fā)生率低，表達(dá)強(qiáng)者其轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。

10、2.Tiam1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及建立穩(wěn)定表達(dá)Tiam1的結(jié)直腸癌細(xì)胞株 應(yīng)用RT-PCR檢測9種結(jié)直腸癌細(xì)胞株Tiam1基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HT29細(xì)胞內(nèi)源性不表達(dá)Tiam1基因。將Tiam1質(zhì)粒導(dǎo)入HT29細(xì)胞中，挑取G418抗性單克隆，RT-PCR及Westernblot確定Tiam1在轉(zhuǎn)染克隆1中表達(dá)最強(qiáng)(命名為HT29/Tiam1)，Tiam1在空載體對照中不表達(dá)(命名為HT29/mock)。 3.Tiam1過表達(dá)對結(jié)直腸

11、癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 通過MTT法，我們檢測了Tiam1對結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖能力的影響，與HT29/mock細(xì)胞相比，HT29/Tiam1細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)(F=239.197，P＜0.01)。此外，接種HT29/Tiam1細(xì)胞的裸鼠皮下腫瘤生長明顯加快(F=48.410，P＜0.01)，腫瘤體積自皮下注射后的第七天起出現(xiàn)顯著性差異，接種HT29/Tiam1細(xì)胞的裸鼠皮下腫瘤第20天的平均體積是HT29/mock細(xì)胞組的

12、2.5倍。進(jìn)行結(jié)直腸癌細(xì)胞外科原位移植6周后，接種HT29/Tiam1細(xì)胞的裸鼠結(jié)腸原位腫瘤重量明顯大于接種HT29/mock細(xì)胞的裸鼠(t=-14.916，P＜0.01)。 4.整體可視化結(jié)腸癌原位及轉(zhuǎn)移動物模型觀察 本研究建立的結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480/EGFP+穩(wěn)定、高效的表達(dá)綠色熒光蛋白，且增殖能力與SW480相比，沒有顯著性差異(F=1.171，P＞0.05)；采用外科手術(shù)原位移植的方法建立結(jié)腸癌可視化原位動物

13、模型，成功率達(dá)到100％。移植2周后，結(jié)腸原位成瘤，未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移情況，手術(shù)6周后，75％的裸鼠發(fā)生了腹腔轉(zhuǎn)移，50％發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移。通過病理學(xué)方法，驗證了可視化原位及轉(zhuǎn)移動物模型的可靠性。 5.通過RNAi技術(shù)沉默結(jié)直腸癌細(xì)胞株Tiam1表達(dá)，建立Tiam1基因穩(wěn)定沉默的結(jié)直腸癌細(xì)胞株 6.Tiam1基因表達(dá)沉默后對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 MTT法觀察Tiam1基因表達(dá)沉默后體外細(xì)胞的增殖情況，與SW480/

14、EGFP+/mock和SW480/EGFP+細(xì)胞相比，SW480/EGFP+/Tiam1-細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，并且呈時間依賴關(guān)系(F=3.361，P＜0.01)。平板克隆形成實驗顯示SW480/EGFP+/Tiam1-細(xì)胞的活力顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.244，P＜0.05)。這些結(jié)果均說明Tiam1表達(dá)水平減低后，腫瘤細(xì)胞體外生長被顯著抑制。 7.利用基因芯片技術(shù)探討Tiam1在結(jié)直腸癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用利

15、用Affymetrix公司的HG-U133plus2寡核苷酸芯片對SW480/EGFP+/Tiam1-和SW480/EGFP+/mock細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，獲得Tiam1相關(guān)基因1026個，包括與Tiam1作用協(xié)同的基因647個，作用拮抗的基因379個。對獲得的基因進(jìn)行功能分類發(fā)現(xiàn)，與Tiam1基因協(xié)同作用的基因主要涉及了細(xì)胞周期、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、核苷酸代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞生理過程等，與Tiam1基因拮抗作用的基因主要涉及了生

16、物過程負(fù)調(diào)控、抑制酶活性、細(xì)胞過程的負(fù)調(diào)控基因等。對獲得的基因進(jìn)行信號通路分類發(fā)現(xiàn)，參與Tiam1調(diào)節(jié)作用的基因主要涉及了Wnt通路、p53通路、凋亡信號通路、整合素信號通路、PI3K信號通路、Ras信號通路等。 8.利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析Tiam1在結(jié)直腸癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中的功能比較蛋白質(zhì)組學(xué)是當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要策略，通過比較細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)染前后/沉默前后蛋白質(zhì)表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)與目的基因作用相關(guān)的蛋白質(zhì)。 9.

17、Tiam1差異基因和/或蛋白質(zhì)篩選過程中的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的對接在本研究中，我們利用基因芯片和比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選與Tiam1作用的基因和/或蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組對接的基因/蛋白質(zhì)有3個，2個是與Tiam1基因功能協(xié)同的高遷移率族蛋白B1(highmotilitygroupbox1,HMGB1)和磷酸甘油酸變位酶(phosphoglyceratemutase,PGAM1),他們隨著Tiam1基因的表達(dá)上調(diào)而上調(diào)，表達(dá)沉默而下調(diào)；另