胃癌基因芯片差異表達(dá)基因的驗(yàn)證和篩選.pdf

1、背景：胃癌的發(fā)病率和死亡率很高，目前缺乏有效的診治手段?；蛐酒侨媪私馕赴┑陌l(fā)生發(fā)展機(jī)制，篩選生物學(xué)標(biāo)志物的重要手段，但要從中篩選出有價(jià)值的指標(biāo)需要多方面的驗(yàn)證分析。 目的：從基因芯片中篩選有價(jià)值的差異表達(dá)基因。方法：1、挑選8個(gè)基因芯片實(shí)驗(yàn)中顯示的胃癌差異表達(dá)基因，加S100蛋白家族中S100A2，S100A4，AKR1C2共¨個(gè)基因，用RT-PCR和REAL-TIMEPCR方法分析這11個(gè)感興趣基因在22例新鮮胃癌組織及

2、對(duì)應(yīng)的正常胃黏膜組織的差異表達(dá)。 2、構(gòu)建包含208例1020個(gè)組織點(diǎn)有預(yù)后資料胃癌患者的組織芯片，每一例患者組織均進(jìn)行配對(duì)設(shè)計(jì)。 3、用免疫組化方法檢測(cè)了S100A2，S100A4，S100A6蛋白在胃癌芯片中的表達(dá)，構(gòu)建正義以及反義FAM3B基因的CRNA探針，用原位雜交方法檢測(cè)了它在胃癌芯片中的表達(dá)。分析上述基因與胃癌臨床病理指標(biāo)以及預(yù)后的相關(guān)性。 4、構(gòu)建S100A2干擾載體，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，RT-PCR和

3、WESTERN檢測(cè)篩選了S100A2基因的有效干擾序列。 結(jié)果：1、RT-PCR和REAL-TIMEPCR驗(yàn)證的8個(gè)基因中，與基因芯片結(jié)果一致的基因有5個(gè)，它們是：S100A6，IGFBP4，AKR1C2，F(xiàn)AM3B，SAFB1，CKBB。吻合率為62.5％。以BETA-MICROGLOBIN為內(nèi)標(biāo)，用REAL-TIMEPCR定量分析了S100A2，S100A4，S100A6基因表達(dá)，他們?cè)谖赴┲斜磉_(dá)升高的比率分別為80％，55

4、％，74％。表達(dá)升高的倍數(shù)分別為：10.78，2.31，2.25倍。它們相對(duì)于β2-microglobulin表達(dá)豐度分別為2.83E-04，6.44E-02，0.41。 2、成功構(gòu)建了胃癌轉(zhuǎn)移以及預(yù)后組織芯片，共1020點(diǎn)，組織點(diǎn)有效率為98％。 3、免疫組化顯示，正常胃黏膜，癌灶，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶S100A2，S100A4，S100A6陽性表達(dá)率逐漸升高，依次為9.6％/32.2％/43.5％，9.4％/28.1％/32

5、.2％，34.3％/84.1％/90.9％。三個(gè)分子在癌灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)陽性率均高于對(duì)應(yīng)正常胃黏膜(P＜0.05)。正常組織中S100A2的表達(dá)僅與脈管癌栓有關(guān)，有脈管癌栓正常組織中S100A2表達(dá)高于無脈管癌栓者，差異具有顯著性(P=0.0017)。腫瘤組織中S100A2表達(dá)僅與TNM分期有關(guān)，Ⅰ期表達(dá)最低，其余0期，Ⅱ期，Ⅲ期表達(dá)均高于Ⅰ期，差異具有顯著性(P=0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中S100A2的表達(dá)僅在不同年齡組間存在

6、差異，中青年齡組表達(dá)高于老年組((P=0.004)。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)灶中S100A2高表達(dá)者與低表達(dá)者相比，預(yù)后傾向更差(P=0.07)。正常組織中S100A4表達(dá)與各臨床病理因素未發(fā)現(xiàn)相關(guān)。腫瘤組織中S100A4表達(dá)僅與浸潤深度相關(guān)，浸潤至肌層和漿膜層的胃癌表達(dá)高于僅浸潤黏膜和黏膜下層者(P=0.014)。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中S100A4表達(dá)與浸潤深度有關(guān)，隨浸潤深度增加表達(dá)增加，差異具有顯著性(P=0.013)。此外，雖然差異無顯著性，但隨胃癌T

7、NM分期的進(jìn)展，S100A4在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)有增高趨勢(shì)(P=0.054)。S100A4在癌灶中和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)陽性率隨胃癌浸潤深度進(jìn)展而增加(P=0.014，0.013)，癌灶中S100A4表達(dá)高者預(yù)后差(P=0.034)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中S100A4表達(dá)高者預(yù)后差(P=0.002)。S100A6在65.5％的胃癌患者中表達(dá)升高。正常胃黏膜中S100A6表達(dá)僅在不同年齡組中有差異，老年組S100A6表達(dá)高于中青年組(P=0.022)

8、。癌灶中S100A6表達(dá)與腫瘤大小和浸潤深度相關(guān)，腫瘤越大，表達(dá)越高(P=0.022)，浸潤越深，表達(dá)越高(P=0.013)。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中S100A6的表達(dá)僅在不同部位發(fā)生的腫瘤中存在差異，胃竇部的腫瘤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中表達(dá)高于胃體和賁門癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)(P=0.024)。S100A6表達(dá)與預(yù)后無關(guān)，但腫瘤灶與對(duì)應(yīng)正常胃黏膜相比，如果S100A6表達(dá)升高，預(yù)后比S100A6表達(dá)下降者差。S100A2與S100A6之間以及S100A2與S100

9、A4之間在四個(gè)層次表達(dá)均有相關(guān)性。S100A4與S100A6之間僅有弱相關(guān). 4、FAM3B在81.5％胃癌中表達(dá)下降。以灰度值8.0為界值，分為陰性和陽性，從正常胃黏膜至轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，F(xiàn)AM3B陽性率依次降低，差異具有顯著性(P=0.000)。正常胃黏膜中FAM3B表達(dá)與各臨床病理因素?zé)o相關(guān)性。腫瘤組織FAM3B表達(dá)與浸潤深度和TNM分期有關(guān)。局限在黏膜和黏膜下層浸潤者FAM3B表達(dá)高與已經(jīng)浸潤至肌層和漿膜層者，差異具有顯著性(

10、χ2=9.546，P=0.008)；0期胃癌FAM3B表達(dá)高于Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期。(χ2=7.866，P=0.049)。三種組織中FAM3B表達(dá)以及表達(dá)改變程度對(duì)胃癌預(yù)后的影響沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，但FAM3B表達(dá)高者預(yù)后有好于表達(dá)低者的趨勢(shì)(P值分別為0.057，0.129，0.052)。 5、單因素分析表明胃癌預(yù)后的影響因素有：腫瘤病灶大小，組織學(xué)類型，浸潤深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期，腫瘤灶中S100A4表達(dá)水平，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中S

11、100A4表達(dá)水平能夠?qū)ξ赴╊A(yù)后產(chǎn)生影響。多因素分析表明腫瘤病灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期以及正常組織FAM3B表達(dá)水平是胃癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，F(xiàn)AM3B具有保護(hù)作用。分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后表明腫瘤大小，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中S100A4表達(dá)水平以及正常組織FAM3B表達(dá)水平是獨(dú)立影響因子。 6、利用干擾載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SGC-7901，通過RT-PCR，WESTERN檢測(cè)篩選一個(gè)S100A2高效干擾的靶位點(diǎn)，并制備了S100A2cRN

12、A探針，為后續(xù)研究S100A2基因功能打下基礎(chǔ)。 結(jié)論：1、用RT-PCR以及REAL-TIMEPCR驗(yàn)證了基因芯片的結(jié)果，REAL-TIMEPCR提供了精確定量的手段，為后續(xù)從血液水平檢測(cè)胃癌患者基因改變提供了強(qiáng)有力手段。 2、成功構(gòu)建了大樣本的胃癌轉(zhuǎn)移以及預(yù)后的配對(duì)組織芯片，該芯片能夠用于快速篩選與胃癌進(jìn)展相關(guān)的基因，并提供基因的定位信息。 3、S100A6是胃癌細(xì)胞高表達(dá)基因，F(xiàn)AM3B是胃癌細(xì)胞低表達(dá)基因