利用激光捕獲顯微切割及基因芯片技術(shù)構(gòu)建喉鱗狀細胞癌基因組差異表達譜.pdf

1、研究目的： 喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，占頭頸部腫瘤的第二位，喉癌原發(fā)于聲帶部位者居多，約占60％。因為不同患者所患喉癌在病理類型、腫瘤分化程度、就診時病變嚴重程度等方面有差異，因此不同喉癌患者具有不同的臨床表現(xiàn)及體征，對手術(shù)后放療、化療的敏感性各有差異，所以如何找到早期診斷，療效監(jiān)測的分子標志物，將為實現(xiàn)對喉癌的個性化治療奠定理論基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)喉癌標志物的研究主要集中在喉癌相關(guān)的單個基因功能研究，難以從整體上把握喉癌相關(guān)蛋白

2、或基因的變化，更未將顯微切割、組織純化技術(shù)引入到喉癌研究中，因此，使用高通量基因芯片、結(jié)合顯微切割、線性擴增技術(shù)，構(gòu)建并研究不同臨床分期的喉癌組織中癌細胞的差異基因表達譜，對臨床篩選不同用途的分子標記物具有重要的指導(dǎo)意義。 研究方法： (1)建立喉癌組織標本庫及喉癌臨床資料數(shù)據(jù)庫，篩選嚴格配對的8例喉癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常的粘膜組織進行研究。 (2)通過RNA保護以克服組織中RNA降解，應(yīng)用激光捕獲顯微切割技術(shù)

3、以獲得純凈的癌細胞和純凈的正常喉粘膜上皮細胞，體外線性擴增以解決RNA量少的問題，結(jié)合人類全基因組寡核苷酸芯片HG-U133.Plus.2.0芯片，構(gòu)建了16例純化喉組織全基因組表達譜。 (3)對部分特異性候選靶基因進行qRT-PCR,檢測基因的表達情況(4)從喉癌標本組織庫中篩選50對標本，即50例喉癌組織和相對應(yīng)的癌旁正常的粘膜組織，制作成組織芯片，對部分基因進行驗證。 研究結(jié)果： (1)通過SAM等軟件分析

4、，將8對喉癌與癌旁正常組織表達譜依次進行比較，篩選出差異基因2351個；將8對喉癌與癌旁正常組織表達譜進行比較，再將早期癌與晚期癌進行比較處理，篩選出差異基因761個。 (2)對篩選出的基因進行GO分類，主要分為3大類：一、細胞組成為31.96％；二、分子功能為35.26％；三、生物學(xué)過程為32.78％。細胞定位分析發(fā)現(xiàn)：這些靶基因分別作用于細胞核、核膜，細胞漿及胞膜等部位，參與離子轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)、細胞凋亡、多種酶活性、核酸結(jié)合

5、、核酸合成、修飾等功能過程。 (3)對篩選出的基因進行信號通路(pathway)分析，篩選主要的信號通路為：細胞周期，以整合素介導(dǎo)的細胞粘附，基質(zhì)金屬蛋白酶，Wnt信號傳導(dǎo),炎癥反應(yīng)通路，TGF-β通路等主要的信號通路。 (4)對部分特異性候選靶基因進行qRT-PCR試驗，基因MMP12，KRT16，KRT19，HMGA2，在喉癌組織中均表現(xiàn)為上調(diào)，在正常的喉粘膜上皮中表達較弱或不表達。基因KRT23，RARB，PRB1

6、則在喉癌組織中均表現(xiàn)為下調(diào)。上述結(jié)果與基因芯片表達的結(jié)果是一致的。 (5)制作100例標本的組織芯片，對候選靶基因MMP12，HMGA2，RARB進行檢測，結(jié)果顯示：MMP12，HMGA2蛋白在喉癌組織中均出現(xiàn)顯著的高表達，而RARB蛋白在喉癌組織中則出現(xiàn)低表達，三種蛋白的異常表達提示其在喉癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。 研究結(jié)論： (1)通過RNA保護、激光捕獲顯微切割、微量RNA提取及線性擴增等技術(shù)，結(jié)合全