原發(fā)性肝細胞癌基因表達譜和全基因組DNA高分辨率圖譜的構(gòu)建與分析.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一,在中國更是位居腫瘤致死性疾病的第二位,嚴重危害了我國人民健康。多年來科學家們在HCC的基礎(chǔ)和臨床研究中取得了顯著成就,但由于HCC的高度異質(zhì)性,還需要更多的研究來進一步加深對其致病分子機理的認識和理解。本研究中,我們從尋找HCC差異表達基因和基因組DNA水平異常改變兩方面入手,對HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制進行了探討。
　　在第一部分研

2、究工作中,我們應(yīng)用SAGE和LongSAGE技術(shù)構(gòu)建了正常肝組織、HepG2細胞和HCC的基因表達譜,其中用于構(gòu)建HCC的SAGE文庫和LongSAGE文庫的組織標本來自于同一個病人。通過對HepG2細胞與正常肝組織的基因表達譜的比較分析,我們發(fā)現(xiàn)在HepG2細胞中差異表達的基因主要涉及編碼核糖體蛋白的基因、MAPK信號傳導通路基因、細胞周期相關(guān)基因、細胞粘附相關(guān)基因、鈣離子信號傳導通路基因、凝血和補體功能相關(guān)的基因以及煙酸/煙酰胺代謝

3、相關(guān)的基因。比較HCC與正常肝組織的基因表達譜的差異,我們發(fā)現(xiàn)在HCC中差異表達的基因主要包括細胞合成、細胞增殖與死亡、信號傳導、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、凝血功能、細胞代謝以及細胞對外界刺激發(fā)生反應(yīng)等生物過程相關(guān)的基因。選取部分差異表達基因進行驗證,結(jié)果表明,PEG10、SGCE、ZNF83、PTPN12和TM4SF1基因等12個基因在肝癌組織中的表達高于相應(yīng)的癌旁組織,差異具有顯著性(p＜0.05)。值得注意的是,SGCE和PEG10基因共同位于7

4、q21區(qū)域,兩基因的5'端僅相距115bp,并且兩基因在75％的HCC病例中同時發(fā)生表達上調(diào)或下調(diào),以上調(diào)為主。
　　在第二部分研究工作中,我們借助Digitalkaryotyping技術(shù)和GenomeSequencerFLX超高通量第二代測序系統(tǒng),繪制了HCC全基因組DNA異常改變的高分辨率圖譜。我們將GenomeSequencerFLX測序系統(tǒng)自備的平端接頭改造為粘端接頭,從而保留了基因組序列標簽串聯(lián)體的粘性末端所攜帶的信息,

5、提高了測序效率。Digitalkaryotyping文庫總共測序111,585條,得到358,931個有效序列標簽。通過對序列標簽數(shù)據(jù)的分析,發(fā)現(xiàn)在HCC中發(fā)生擴增的染色體主要有1、4、6、7、8、9、12、15、17、19、21、X和Y染色體,發(fā)生擴增的染色體區(qū)域內(nèi)包含了BAGE、UTRN、DYNC111、SLC25A13、POTEB和CEACAM21等多個基因。其中DYNC111和SLC25A13基因在染色體上的位置鄰近PEG10和

6、SGCE基因,也位于7q21區(qū)域。進一步的研究發(fā)現(xiàn),DYNC111、SLC25A13、POTEB、CEACAM21、PEG10和SGCE基因分別在36％、52％、50％、36％、23％和32％的HCC病例中出現(xiàn)基因組DNA的擴增,且PEG10、SGCE、DYNC111和SLC25A13基因在HCC中的表達顯著高于相應(yīng)的癌旁組織(p＜0.05)。在55～69％的HCC病例中,PEG10、SGCE、DYNC111和SLC25A13基因組DN

7、A的擴增同時伴有基因表達水平的上調(diào)。這些結(jié)果提示,位于7q21區(qū)域的4個基因—PEG10、SGCE、DYNC111和SLC25A13可能共同參與了HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制,而基因組DNA的擴增可能是這些基因表達上調(diào)的原因之一。
　　酪氨酸磷酸酶的異常失活或激活,導致蛋白質(zhì)分子中酪氨酸殘基的磷酸化水平異常升高或降低,是HCC的重要生物學特征之一。在第三部分研究工作中,我們應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù),對受體型酪氨酸磷酸酶PCP-2相互作用蛋白

8、進行了初步研究。通過篩選人腦組織酵母cDNA文庫,找到可能與PCP-2發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)—銜接蛋白3(adaptorprotein-3,AP-3)的β3A亞基,并在哺乳動物細胞中進一步驗證了兩者之間的相互作用。AP-3的β3A亞基可能通過識別PCP-2胞漿區(qū)的YXXΦ模體和/或LL模體與PCP-2結(jié)合,從而參與PCP-2細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、定位、以及受體的循環(huán)再利用等過程。
　　我們通過對HCC基因轉(zhuǎn)錄水平和基因組DNA水平異常改變的研