HBV-HCV陰性的原發(fā)性肝細(xì)胞癌全基因組DNA甲基化分析及部分功能基因的表達(dá)水平驗(yàn)證.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌在中國(guó)的發(fā)病率和死亡率都排在各類腫瘤疾病的前列，由于發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速，大多數(shù)病人就診時(shí)已經(jīng)是中晚期。DNA甲基化作為主要的表觀調(diào)控機(jī)制，近年來(lái)在受到了大量關(guān)注。本研究通過(guò)檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌病人的癌組織及其配對(duì)的癌旁組織的全基因組甲基化水平差異、基因表達(dá)差異及蛋白表達(dá)差異來(lái)探索原發(fā)性肝細(xì)胞癌的特征性甲基化譜和原發(fā)性肝細(xì)胞癌的關(guān)系。
　　方法：1.芯片數(shù)據(jù)的獲取:(1)收集來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院標(biāo)本庫(kù)、第一附屬醫(yī)

2、院手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌組織及與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織共18對(duì)（36例）標(biāo)本，均得到患者知情同意。將基因組DNA分離后進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，然后采用illumina HumanMethylation27芯片平臺(tái)得到全基因組DNA甲基化數(shù)據(jù)，并結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中符合我們研究標(biāo)準(zhǔn)的HBV、HCV病毒感染陰性的甲基化芯片數(shù)據(jù)，采用R語(yǔ)言的RnBeads包進(jìn)行背景校正;質(zhì)控后統(tǒng)計(jì)得到差異甲基化位點(diǎn)。(2)經(jīng)過(guò)功能富集、通路富集分析后選取感興趣的

3、差異甲基化位點(diǎn)進(jìn)行下一步分析。2、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證:(1)對(duì)我們感興趣的位點(diǎn)所在的基因設(shè)計(jì)甲基化特異性引物，用PyroMark Assay Design2.0甲基化引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異位點(diǎn)所在基因的上、下游引物和甲基化測(cè)序引物，聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。使用QIAGEN的PyroMark Q96焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)平臺(tái)檢測(cè)所選基因在肝細(xì)胞癌組織及其相應(yīng)的

4、癌旁組織中的DNA甲基化水平。(2)收集新的樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtimefluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)以及免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）染色檢測(cè)所選基因在肝細(xì)胞癌組織、與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)情況。所有的統(tǒng)計(jì)工作由R軟件包完成，設(shè)定α=0.05。
　　結(jié)果：1、臨床特征:納入芯片研究的樣本平均患者平均年齡54.9±11.5歲，其中

5、男性17例，女性1例。有吸煙史的12人，飲酒者6人。2、甲基化芯片檢測(cè)結(jié)果:使用limma包提供的經(jīng)驗(yàn)貝葉斯法用等級(jí)線性模型計(jì)算P值，進(jìn)一步以甲基化狀態(tài)發(fā)生跨級(jí)躍遷同時(shí)滿足|Delta Beta|＞0.2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出了444個(gè)基因做進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析，其中包含了271個(gè)低甲基化位點(diǎn)、223個(gè)高甲基化位點(diǎn)。3、功能注釋:高甲基化位點(diǎn)所在的基因功能多集中在發(fā)育、細(xì)胞過(guò)程和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力等方面;而低甲基化位點(diǎn)所在基因的功能多集中在角

6、質(zhì)化和應(yīng)激方面。對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)樣本能夠很好地被區(qū)分開來(lái)。4、基于功能分析及文獻(xiàn)檢索，我們首次選擇了2個(gè)甲基化水平顯著降低的個(gè)基因(LRSAM1、VAV1)的甲基化位點(diǎn)做了焦磷酸測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩者均在肝細(xì)胞癌組織中呈現(xiàn)低甲基化現(xiàn)象，與芯片結(jié)果完全一致，并且與芯片甲基化程度Beta值呈線性相關(guān)。5、用RT-qPCR檢測(cè)以上基因的mRNA水平，結(jié)果顯示LRSAM1（0.43±0.93，p=0.011）以及VAV1（0.84±1.8

7、2，p=0.011）的mRNA水平則在癌組織中顯著上調(diào)。6、用免疫組化技術(shù)驗(yàn)證以上基因編碼蛋白在組織切片中的表達(dá)情況。與mRNA驗(yàn)證結(jié)果一致，LRSAM1、VAV1在癌與癌旁表達(dá)陽(yáng)性率分別為82％(37/45)-42％(13/31)，57％(26/46)-41％(15/37)。
　　結(jié)論：1、初步建立了原發(fā)性肝細(xì)胞癌的特征甲基化譜，為后續(xù)功能和機(jī)制的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。2、我們首次發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了LRSAM1、VAV1在原發(fā)性肝細(xì)胞