山羊DIO3基因組織特異性表達(dá)及DNA甲基化分析.pdf

1、DIO3基因在甲狀腺激素代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，它對胎兒發(fā)育、新生兒生長有著非常重要的作用，尤其對哺乳動物大腦的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。為了進(jìn)一步理解DIO3基因的結(jié)構(gòu)和功能，我們從南江黃羊的心肌中分離鑒定出DIO3基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究南江黃羊在出生后3d、30 d、60 d、90 d和120 d這5個(gè)生長階段DIO3在不同組織中mRNA水平的表達(dá)差異。同時(shí)應(yīng)用原位雜交技術(shù)對大腦不同區(qū)域的DIO3 mRNA進(jìn)行了定位

2、分析;此外，采用MassArray甲基化定量檢測方法對出生后3d的南江黃羊不同組織DIO3基因內(nèi)部的CpG島的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了檢測。主要結(jié)果如下:
　　(1)克隆得到南江黃羊DIO3基因的編碼區(qū)全序列，長度為906 bp，編碼的氨基酸數(shù)目為301個(gè);山羊DIO3的編碼序列與小鼠、大鼠、人、豬、綿羊和牛的序列相似度分別為83.61％、84.37％、88.52％、90.20％、90.95％和97.46％;而DIO3的編碼氨基酸序列與牛

3、的同源性為98.67％，與小鼠、大鼠、綿羊、人和豬的相似度分別為89.47％、89.80％、92.36％、92.76％和93.11％。保守的TGA密碼（編碼硒代半胱氨酸）對催化活性是至關(guān)重要的。
　　(2)對DIO3基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，DIO3蛋白的分子重為33.9 kDa，且理論等電點(diǎn)為6.45。DIO3氨基酸包含11個(gè)磷酸化位點(diǎn);二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)山羊DIO3蛋白主要由α-螺旋(41.20％)、無規(guī)卷曲(44.52％)

4、和延伸片段(14.29％)組成。進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果表明山羊DIO3的核苷酸序列同綿羊和牛的親緣關(guān)系最近，山羊DIO3首先與綿羊形成一支，然后再和牛、豬和犬類形成一個(gè)分支;且山羊DIO3與哺乳動物的親緣關(guān)系更近，而與三斑海豬魚和藍(lán)刻齒雀鯛的親緣關(guān)系要遠(yuǎn)。
　　(3)在南江黃羊出生后的五個(gè)時(shí)期均檢測到了DIO3 mRNA的表達(dá)，但在肝、腎和背最長肌中的表達(dá)水平較高;其次為心和腦;在肺中的表達(dá)水平較低。
　　(4)原位雜交探針成功揭

5、示了DIO3 mRNA在大腦不同區(qū)域的空間表達(dá)模式。在大腦皮質(zhì)中，DIO3 mRNA在腦膜和分子層的表達(dá)十分微弱，但其中的神經(jīng)纖維表達(dá)卻十分明顯。DIO3轉(zhuǎn)錄物在腦干中的神經(jīng)元和神經(jīng)纖維網(wǎng)中廣泛分布。在小腦的分子層、浦肯野細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層中，DIO3 mRNA普遍呈現(xiàn)出中等程度的表達(dá)，但在小腦白質(zhì)中呈現(xiàn)出極高濃度的表達(dá)。此外，在延髓中，DIO3 mRNA的表達(dá)信號主要集中于神經(jīng)纖維網(wǎng)。相似的，DIO3 mRNA在下丘腦和白髓中的表達(dá)也

6、主要分布于神經(jīng)纖維網(wǎng)中。
　　(5)山羊DIO3基因包含一個(gè)保守的CpG島，幾乎覆蓋整個(gè)編碼區(qū)(g.71-851)，共包括51個(gè)CpG位點(diǎn)，且它們的平均甲基化水平位于0.03-0.79之間。在不同的組織中甲基化模式具有保守性。甲基化分析結(jié)果顯示DIO3基因內(nèi)部的CpG島的甲基化程度在5'區(qū)域和3'區(qū)域存在差異，編碼區(qū)內(nèi)的5'區(qū)域(CpGs_1～24)的甲基化程度顯著低于(P＜0.01)3'區(qū)域(CpGs_25～51);六個(gè)測試組織