人胰島素基因改造及其山羊乳腺特異性表達載體構(gòu)建.pdf

1、為了構(gòu)建一個高效的經(jīng)改造后的人胰島素基因乳腺特異性表達載體，從而為利用動物乳腺生產(chǎn)人成熟胰島素打下基礎(chǔ)，我們利用Long PCR技術(shù)克隆了長為5151 bp的山羊β酪蛋白基因5P＇調(diào)控區(qū)，并且在克隆出改造后的人胰島素基因的基礎(chǔ)上，以奶牛β酪蛋白基因調(diào)控區(qū)為指導元件，以綠色熒光蛋白(EGFP)為報告基因，構(gòu)建了人胰島素基因的乳腺特異性表達載體pEBH，為利用動物乳腺生物反應器生產(chǎn)人成熟胰島素的研究打下了堅實的基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：

2、1.利用Long PCR技術(shù)成功從人基因組中擴增出長度為1696 bp人胰島素基因，又以人胰島素為模板分三段擴增出長度為262 bp的A肽、218 bp的B肽、928 bp的C肽，連接C肽和A肽。其中包含有完整的編碼序列。序列分析表明，片段和GenBank中公布的人胰島素基因DNA序列的同源性為99％，盡管有三處發(fā)生了堿基突變，但不在主要功能區(qū)并沒有改變蛋白的功能。 2.根據(jù)表達載體pEGFP-C1上的多克隆位點以及質(zhì)粒pBL中

3、的CSN2啟動子序列設(shè)計引物，在引物兩端添加酶切位點，采用定向克隆的方法，成功的將HBCA基因與CSN2調(diào)控序列融合在一起。 3.采用定向克隆的方法，利用真核表達載體pEGFP-C1構(gòu)建了含有報告基因的人胰島素乳腺特異性表達載體pEBH。載體含有抗性基因和綠色熒光蛋白(EGFP)基因，且報告基因和目的基因表達為非融合型表達。 4.用脂質(zhì)體法將表達載體pEBH轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞，經(jīng)G418初步篩選，通過熒光顯微

4、鏡觀察到報告基因的表達。通過PCR檢測，表明HBCA基因序列已存在山羊乳腺上皮細胞染色體中。 5.采用Long PCR法，克隆了山羊CSN2基因長為5151bp的5＇調(diào)控區(qū)。經(jīng)NCBI blasm軟件進行同源性序列分析，結(jié)果表明：所克隆的片段與山羊CSN2基因?qū)獏^(qū)段的同源性均為99％，證明為山羊β酪蛋白基因的5＇調(diào)控區(qū)。利用本試驗克隆的5＇調(diào)控區(qū)和本實驗室已有的長為6.6 kb的3＇調(diào)控序列，可以構(gòu)建高效的乳腺特異性表達載體。