內(nèi)蒙古白絨山羊LEF1基因皮膚特異性表達(dá)載體及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、淋巴增強(qiáng)因子-1(Lymphoid enhancer factor1,LEF1)是淋巴增強(qiáng)因子／T-細(xì)胞因子(LEF／TCF)家族的成員之一,也是Wnt經(jīng)典通路中的一個核心成分。LEF1通過與β-連環(huán)蛋白結(jié)合形成β-連環(huán)蛋白／LEF復(fù)合物,活化目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)控細(xì)胞分化和組織自我更新,LEF1與毛囊發(fā)育及自我更新也密切相關(guān)?？寺?nèi)蒙古白絨山羊淋巴樣增強(qiáng)因子-1(Lymphoid enhancer factor,LEF1)基因,構(gòu)建皮膚特

2、異性表達(dá)載體 pCDsRed-KL、pCDsRed-UL；轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞,篩選出穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白并可用于核移植的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆。RT-PCR克隆LEF1基因cDNA序列,將LEF1基因到KAP6-1啟動子下游,接續(xù)連接紅色熒光蛋白表達(dá)元件,構(gòu)建LEF1基因毛囊特異表達(dá)載體 pCDsRed2-KL。外源表達(dá)載體以lipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞,通過 G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)

3、染的細(xì)胞克隆,PCR鑒定外源基因在胎兒成纖維細(xì)胞基因組中的整合；PCR克隆小鼠 UHS啟動子,與LEF1以及紅色熒光蛋白表達(dá)元件連接構(gòu)成皮膚特異性表達(dá)載體 pCDsRed-UL。外源表達(dá)載體以lipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞,通過G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆,PCR鑒定外源基因在細(xì)胞基因組中的整合；組織塊直接培養(yǎng)法得到內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞初代培養(yǎng)物,用酶消化法純化皮膚成纖維細(xì)胞。lipofect

4、amineTM2000介導(dǎo)pCDsRed-KL、pCDsRed-UL轉(zhuǎn)染皮膚成纖維細(xì)胞,通過G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆,RT-PCR檢測 pCDsRed-KL、pCDsRed-UL在皮膚成纖維細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄。
　　 本實(shí)驗(yàn)表明：⑴內(nèi)蒙古白絨山羊LEF1基因cDNA全長1159bp,包含了1116bp的完整ORF(HM059927)。測序顯示構(gòu)建的表達(dá)載體中,LEF1基因正確連接在皮膚特異性 KAP6-1啟動子,順序連接 C

5、MV啟動子和紅色熒光蛋白基因,pCDsRed-KL載體構(gòu)建正確。PCR檢測顯示外源 KAP6-1啟動子和 LEF1基因整合到細(xì)胞基因組中,篩選出的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞高效表達(dá)紅色熒光蛋白。⑵克隆的小鼠UHS啟動子全長670bp bp。測序顯示構(gòu)建的表達(dá)載體中,LEF1基因正確連接在小鼠UHS啟動子下游,順序連接CMV啟動子和紅色熒光蛋白基因,pCDsRed-UL載體構(gòu)建正確。經(jīng)G418篩選得到高效表達(dá)紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆。PCR檢測顯示外源

6、 KAP6-1啟動子和 LEF1基因整合到細(xì)胞基因組中。⑶分離純化得到內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞。pCDsRed-KL、pCDsRed-UL轉(zhuǎn)染皮膚成纖維細(xì)胞,經(jīng) G418篩選得到高效表達(dá)紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆。RT-PCR檢測顯示 pCDsRed-KL、pCDsRed-UL在皮膚成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄 LEF1?？寺〉絻?nèi)蒙古白絨山羊 LEF1基因 cDNA,成功構(gòu)建皮膚特異性表達(dá) LEF1和穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的真核表達(dá)載體 pCDs