內(nèi)蒙古白絨山羊轉(zhuǎn)VEGF基因細胞系的建立與VEGF基因新剪接變體(VEGF138)的發(fā)現(xiàn).pdf

1、目的：克隆內(nèi)蒙古白絨山羊 VEGF基因,構(gòu)建毛囊特異性表達載體pCDsRed2-KV,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細胞,篩選獲得穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白和毛囊特異表達VEGF的轉(zhuǎn)基因的細胞克隆。檢測VEGF基因在皮膚細胞中的表達。此外本研究嘗試發(fā)現(xiàn)新的剪接變體。檢測VEGF138是否存在于內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞中,檢測內(nèi)蒙古白絨山羊腦、心臟、肝、脾、腎、肺6種組織中VEGF164、VEGF138和VEGF120三種剪接變體的mRNA豐度。

2、
　　 方法：采用RT-PCR技術(shù)克隆內(nèi)蒙古白絨山羊VEGF基因 cDNA,并進行生物信息學(xué)分析。以pCDsRed2載體為基本骨架將VEGF164基因cDNA序列亞克隆到 KAP6-1啟動子下游,接續(xù)連接紅色熒光蛋白表達元件 DsRed,構(gòu)建VEGF164基因毛囊特異表達載體pCDsRed2-KV。外源表達載體以lipofectamine TM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細胞,G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆,PCR鑒定外源基因

3、在細胞基因組中的整合。pCDsRed2-KV載體轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞,RT-PCR檢測VEGF mRNA表達量,Western blot檢測VEGF蛋白的表達。利用Taqman探針熒光實時定量方法確認新發(fā)現(xiàn)的剪接變體VEGF138存在于內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞中。采用SYSR Green熒光實時定量檢測VEGF164、VEGF138和VEGF120三種剪接變體在內(nèi)蒙古白絨山羊6中組織中的mRNA豐度。
　　 結(jié)果

4、：克隆到內(nèi)蒙古白絨山羊VEDF基因的三個剪接變體VEGF164、VEGF138和VEGF120的cDNA序列,其中VEGF138是首次發(fā)現(xiàn)。VEGF164cDNA序列573bp,包含了全長ORF,編碼190個氨基酸,N端的26個堿基為信號肽序列；VEGF138 cDNA序列495bp,包含了全長ORF,編碼164個氨基酸,N端的26個堿基為信號肽序列；VEGF120 cDNA序列441bp,包含了全長ORF,編碼146個氨基酸,N端的2

5、6個堿基為信號肽序列。VEGF164、VEGF138和VEGF120三種剪接變體在內(nèi)蒙古白絨山羊腦、心臟、肝、脾、腎、肺組織中均有表達,但VEGF138的mRNA豐度遠小于VEGF165和VEGF120。測序結(jié)果顯示表達載體pCDsRed2-KV中,VEGF164基因正確連接在毛囊特異性啟動子 KAP6-1下游,順序連接CMV啟動子和紅色熒光蛋白基因,載體構(gòu)建正確。篩選得到轉(zhuǎn)基因細胞克隆,PCR檢測顯示外源KAP6-1啟動子和VEGF1

6、64基因整合到細胞基因組中。轉(zhuǎn)染VEGF基因的內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚細胞中,VEGFmRNA表達量和蛋白表達量均有明顯增加。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白和毛囊特異表達 VEGF164的真核表達載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細胞,并為進一步通過轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)獲得毛囊特異性超表達VEGF164基因絨山羊新品系提供了條件。VEGF基因在內(nèi)蒙古白絨山皮膚細胞中表達為轉(zhuǎn)基因絨山羊新品系建立提供了理論基礎(chǔ)。VEGF基因在內(nèi)蒙古白絨