毛囊特異性表達(dá)VEGF164條件打靶載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的篩選與鑒定.pdf

1、哺乳動(dòng)物絨毛生長調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，經(jīng)歷毛囊的發(fā)育、分化和絨毛生長等過程，這一過程受到許多功能基因和生長相關(guān)因子的調(diào)控。毛囊特異性表達(dá)外源功能基因促進(jìn)絨毛生長，培育高產(chǎn)絨量轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新品系是近年研究的熱點(diǎn)之一。同時(shí)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性問題也顯得十分重要，如何刪除用于篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆的標(biāo)記基因是解決安全性問題的關(guān)鍵。本研究從選擇毛囊特異性啟動(dòng)子和條件性刪除標(biāo)記基因兩方面入手，首先克隆毛囊特異性表達(dá)的人表皮角蛋白14啟動(dòng)子(Humke

2、ratin14promoter,K14p)，然后構(gòu)建pK14-DsRed2-1載體驗(yàn)證K14p的特異性。通過引入Cre/LoxP基因敲除系統(tǒng)構(gòu)建毛囊特異性表達(dá)VEGF164的條件打靶載體pCDsRed2-K14VL，分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆，檢測VEGF164基因在不同細(xì)胞中的表達(dá)量。最后獲得毛囊特異性表達(dá)外源VEGF164及可通過Cre酶刪除標(biāo)記基因的核移植細(xì)胞供體。<

3、br>　　實(shí)驗(yàn)采用PCR技術(shù)克隆人表皮角蛋白14啟動(dòng)子，并進(jìn)行啟動(dòng)子信息分析。以pDsRed2-1載體為基本骨架將K14啟動(dòng)子序列亞克隆到紅色熒光蛋白表達(dá)元件DsRed上游，構(gòu)建驗(yàn)證毛囊特異性載體pK14-DsRed2-1。通過融合PCR法，構(gòu)建含有毛囊特異性啟動(dòng)子K14p和LoxP序列原件-K14p-VEGF164-K14PolyA-LoxP-CDsRed-的毛囊特異性表達(dá)VEGF164的條件打靶載體pCDsRed2-K14VL。打靶

4、載體以lipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，PCR鑒定外源基因在細(xì)胞基因組中的整合，采用SYBRGreen熒光實(shí)時(shí)定量檢測VEGF164mRNA在兩種細(xì)胞中的表達(dá)量，Westernblot檢測VEGF蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)。
　　結(jié)果表明克隆的人表皮角蛋白14(K14)啟動(dòng)子，長度為2274bp，與NCBI上報(bào)道的人表皮角蛋白14啟動(dòng)子序列(

5、DQ343282.1)有99.5％的相似性。核苷酸序列中GC含量為56％，TATA位點(diǎn)位于2169bp，序列中CpG島序列起始于2061bp終止于2265bp。構(gòu)建的毛囊特異性表達(dá)VEGF164基因的條件打靶載體pCDsRed2-K14VL經(jīng)測序驗(yàn)證構(gòu)建正確，載體元件K14啟動(dòng)子，VEGF164基因，K14PolyA，CMV啟動(dòng)子，Loxp和紅色熒光蛋白均按正確順序連接。pCDsRed2-K14VL轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)

6、胞，分別篩選得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆，PCR檢測顯示外源載體序列整合到了細(xì)胞基因組中。RT-PCR和Westernblot檢測表明轉(zhuǎn)染VEGF164基因的內(nèi)蒙古白絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞中的VEGF164蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量與內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞相比均有明顯增加。表明外源VEGF164基因在皮膚成纖維細(xì)胞中得到特異性表達(dá)。
　　本研究正確克隆了人K14基因啟動(dòng)子并通過對比表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其具有毛囊特異性啟動(dòng)功能。成功構(gòu)建條件性去除