山羊乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)特性的研究.pdf

1、為了構(gòu)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的山羊乳腺特異性表達(dá)載體,利用高保真聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從中國(guó)奶山羊基因組中擴(kuò)增出6個(gè)β-乳球蛋白(BLG)基因片段和1個(gè)β-酪蛋白(β-casein)基因片段.序列測(cè)定結(jié)果證明,所獲基因片段的DNA序列與已發(fā)表的山羊及綿羊相應(yīng)基因區(qū)域具有很高的同源性,5-端調(diào)控區(qū)中主要的乳腺特異表達(dá)調(diào)控元件完全相同,不僅說(shuō)明此兩個(gè)基因在山羊、奶山羊和綿羊之間是高度保守的,而且說(shuō)明所用的DNA聚合酶具有很高的保真性,所擴(kuò)增的

2、基因片段可用于乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建.將上述基因片段進(jìn)行組合,構(gòu)建成一系列乳腺特異性表達(dá)載體.將lacZ報(bào)告基因分別克隆入自行構(gòu)建的p205C3載體和從國(guó)外引進(jìn)的pCX及pHC載體,將所獲得的重組載體分別用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染奶山羊乳腺上皮細(xì)胞系,經(jīng)泌乳激素誘導(dǎo)后用X-gal進(jìn)行酶組化染色,結(jié)果表明自行構(gòu)建的載體驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)水平高于從國(guó)外引進(jìn)的、已知具有高表達(dá)性能的載體.上述重組載體在COS—1細(xì)胞和山羊皮膚成纖維細(xì)胞不能表達(dá)相應(yīng)的報(bào)