bcr-abl融合基因特異性多重siRNAs真核表達載體的構建.pdf

1、研究背景：
　　 慢性髓細胞性白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一種造血干細胞的惡性克隆性疾病，其發(fā)病機制為染色體易位t（9；22）（q34；q11），由于bcr基因斷裂點的不同，產(chǎn)生不同的bcr/abl融合基因，CML最主要的是b3a2這一型融合（95％以上），其表達的P210BCR/ABL融合蛋白具有異常增強的酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosinekinase，PTK）活性，通過改

2、變造血細胞內(nèi)一系列信號傳導途徑，調(diào)控細胞的粘附、增殖和凋亡，導致細胞惡性擴增而致病。因此探索有效抑制bcr/abl融合基因，下調(diào)P210BCR/ABL的形成，或拮抗P210BCR/ABL的PTK活性以及阻斷P210BCR/ABL介導的傳導通路等已成為治療的新策略。人工合成的P210BCR/ABLPTK抑制劑（TKI）甲磺酸伊馬替尼（ST1571,商品名格列衛(wèi)），可特異性阻斷P210BCR/ABL的酪氨酸激酶活性，在CML臨床應用中已取得

3、良好療效，使CML的治療進入一個新的時代。然而，有部分病人出現(xiàn)不能耐受的毒副作用，還有部分病人逐漸出現(xiàn)耐藥，耐藥的主要原因為bcr/abl基因上的點突變、bcr/abl基因過度擴增和表達，雖然目前第二代的酪氨酸激酶抑制劑尼洛替尼、達沙替尼能解決大部分耐藥問題，但難免也會逐漸出現(xiàn)耐藥，而且這種TKI的作用靶點是bcr/abl融合基因下游的融合蛋白，并不能真正解決bcr/abl融合基因之病根，理論上說不能治愈CML，因此針對bcr/abl融

4、合基因作為理想分子靶點的基因治療也是研究的熱點之一。
　　 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是最近十幾年發(fā)展起來的一項新興的在轉(zhuǎn)錄后水平的基因阻斷技術，與以往的基因阻斷技術比較，如基因敲除、反義寡核苷酸技術等，RNAi更具有快速、有效和序列特異性強等優(yōu)點。已有研究證明，針對bcr/abl mRNA融合位點設計的siRNA能夠顯著下調(diào)K562細胞中bcr/abl基因表達，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。但是這種

5、體外化學合成的siRNA很容易降解，不穩(wěn)定，產(chǎn)生的RNAi效應短暫。篩選高效siRNA和使之持久穩(wěn)定的表達，利用真核表達載體在哺乳動物細胞內(nèi)合成表達有發(fā)卡結(jié)構的siRNA，是體外合成siRNA有效的替代方案，這種方案更接近生物體產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象的自然機制并有可能用于基因治療。本實驗利用本課題組先前構建好的一系列可包含1～6個siRNA表達單位的表達型載體，首先設計構建針對bcr/abl融合基因的單一siRNA真核細胞表達載體，轉(zhuǎn)染K56

6、2細胞株，檢測細胞株bcr/abl mRNA及BCR/ABL融合蛋白的表達水平，證實該表達載體能在細胞內(nèi)發(fā)生作用，并對bcr/abl基因有干擾效應；然后在此研究基礎上，我們設計構建針對bcr/abl融合基因的多重siRNAs表達型載體，來放大和強化這種siRNA的RNAi效應，為進一步探索CML的基因治療提供一種新的手段。
　　 目的：構建針對bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表達載體，為進一步探索siRNA的體內(nèi)研究

7、及CML基因治療的新策略，提供一種技術手段。
　　 方法：
　　 第一部分：bcr/abl融合基因單個siRNA真核表達載體的構建與鑒定
　　 1.K562白血病細胞株在加有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，5％CO2條件下37℃培養(yǎng)。
　　 2.根據(jù)文獻已證實有效的、針對bcr/abl基因特異性siRNA序列，將模板序列克隆至p1-siRNA質(zhì)粒中，并酶切、測序鑒定。
　　 3.用脂質(zhì)體L

8、ipofectamineTM LTX將測序正確的重組子轉(zhuǎn)染至K562細胞株中，利用RT－PCR、Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染后細胞株中bcr/abl mRNA和BCR/ABL融合蛋白的表達水平，以及通過MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖情況和使用Annexin V聯(lián)合PI法流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，這樣不僅再次驗證所選siRNA序列的有效性，同時也證明我們所選用的這一siRNA真核表達載體系統(tǒng)的有效性。
　　 第二部分：bcr

9、/abl融合基因的多重siRNAs真核表達載體的構建
　　 在上述證實siRNA序列和siRNA表達載體系統(tǒng)有效的基礎上，重復性將相同的和不同的siRNA接入含多個siRNA表達單位的載體p6-siRNA中，構建針對bcr/abl基因的多重siRNAs真核表達型載體。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)酶切、測序驗證，bcr/abl融合基因的siRNA真核表達載體的模板序列與設計序列完全正確，成功構建p1-siRNA1、

10、p1-siRNA2和p1-siRNAn質(zhì)粒。
　　 2.通過陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM LTX將p1-siRNA1和p1-siRNA2、p1-siRNAn質(zhì)粒以及GFP陽性對照質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到K562細胞株中，經(jīng)熒光顯微鏡觀察綠色熒光，估計轉(zhuǎn)染效率：約30％。
　　 3.轉(zhuǎn)染特異性質(zhì)粒p1-siRNA1和非特異性質(zhì)粒p1-siRNAn的K562細胞株比較：bcr/abl mRNA水平降低了27.6％，BCR

11、/ABL蛋白表達水平下降了30.6％；再比較相應的細胞增殖抑制率和細胞凋亡率，分別為40.1％ vs 16.5％和9.65％ vs 1.79％。同樣，簡單地比較了轉(zhuǎn)染特異性質(zhì)粒p1-siRNA2和非特異性質(zhì)粒p1-siRNAn的K562細胞株的bcr/abl mRNA水平降低了28.7％。
　　 由以上結(jié)果證明所選擇的兩個siRNA序列和siRNA真核表達載體系統(tǒng)確實有效，因此可以繼續(xù)構建bcr/abl融合基因的多重siRNA真

12、核表達載體。
　　 4.經(jīng)酶切、測序驗證，bcr/abl融合基因的多重siRNA真核表達載體的模板序列與設計序列完全正確，成功構建針對bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表達載體。
　　 結(jié)論：
　　 1.我們所構建的針對bcr/abl融合基因siRNA真核表達載體p1-siRNA1質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM LTX轉(zhuǎn)染到K562細胞株中，經(jīng)RT－PCR和Western Blot