hTMEM16A-特異性肽段-GST融合蛋白克隆、表達(dá)、純化、多抗制備及hTMEM16A的克隆和真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、鈣離子激活的氯離子通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)在許多生理學(xué)過(guò)程中都扮演著重要的作用。但是直到最近，其分子基礎(chǔ)即跨膜蛋白TMEM16A(Transmembrane protein 16A，TMEM16A)才被三個(gè)研究小組用不同的策略發(fā)現(xiàn)并證實(shí)。至此以后，對(duì)此基因的研究又向兩個(gè)方向延伸:一方面深入研究TMEM16A的組織表達(dá)定位、分子結(jié)構(gòu)與疾病的關(guān)系等，另一方面，由于TMEM16

2、A屬于TMEM16這個(gè)基因家族的一員，且據(jù)報(bào)道此家族的其他成員也與離子通道功能有關(guān)系，于是也有研究人員研究TMEM16基因家族其他成員的組織表達(dá)定位，并推測(cè)其生理功能。
　　跨膜蛋白16A最近被認(rèn)為是鈣離子激活的氯離子通道蛋白的分子基礎(chǔ)，表達(dá)于許多細(xì)胞和組織中，并在許多癌癥中過(guò)表達(dá)，但其功能尚不清楚。為深入研究人TMEM16A(human TMEM16A，hTMEM16A)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。本文從人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620中提取總RN

3、A，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用PCR擴(kuò)增了hTMEM16A近C端特異性肽段的編碼序列（hTMEM16A-specific peptide coding sequence，hTMEM16A-sp）連接至表達(dá)載體pGEX-2T中，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，酶切、測(cè)序鑒定獲得重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL-21中進(jìn)行高效表達(dá)，用IPTG誘導(dǎo)獲得了可溶性重組蛋白，采用GST親和層析和凝膠過(guò)濾層析的方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行了純化，獲得純度為90％以上、濃度