制備Tet調(diào)控BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)基因小鼠的初步研究.pdf

1、慢性髓細(xì)胞白血病(Chronic Myeloid Leukaemia，CML)是一種起源于多能造血干細(xì)胞異常的骨髓惡性增生性疾病，具有特征性融合基因——BCR-ABL。為進(jìn)一步闡明CML的發(fā)生發(fā)展機(jī)理，人們一直在嘗試制備BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。理想的CML實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型應(yīng)能有效地模擬人類CML疾病的臨床表現(xiàn)，為CML的研究提供理想的實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)。但是目前多數(shù)BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠卻表現(xiàn)為急性淋巴細(xì)胞白血病，試驗(yàn)結(jié)果并不

2、令人滿意。 本實(shí)驗(yàn)室試圖利用Tet-On誘導(dǎo)系統(tǒng)定時(shí)定量的控制BCR-ABL融合基因，在小鼠出生后誘導(dǎo)P210bcr-abl表達(dá)，同時(shí)利用bcr啟動(dòng)子特異控制Tet-On系統(tǒng)調(diào)控蛋白的表達(dá)，使P210bcr-abl在小鼠造血干細(xì)胞和髓系血細(xì)胞中特異表達(dá)。通過(guò)受時(shí)空控制的P210bcr-abl表達(dá)避免P210bcr-abl的胚胎毒性，制備符合人CML慢性期疾病表現(xiàn)的BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠模型，用于CML發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸和干預(yù)的基

3、礎(chǔ)和臨床研究。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功克隆了1.1 kb人bcr啟動(dòng)子并證實(shí)其在髓系細(xì)胞中具有相對(duì)組織特異性表達(dá)的特性，成功構(gòu)建了pber-Tet-On-tTS和pTRE2-BCR-ABL-Hyg兩個(gè)重組質(zhì)粒。 在上述工作的基礎(chǔ)上，我們首先將pbcr-Tet-On-tTs和pTRE2-BCR-ABL-Hyg兩個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞，采用強(qiáng)力霉素DOX誘導(dǎo)bcr啟動(dòng)子控制的調(diào)控蛋白rtTA在髓

4、系血細(xì)胞中特異表達(dá)，雙轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的HL-60細(xì)胞中P210bcr-abl的表達(dá)與DOX濃度存在量效關(guān)系。 在細(xì)胞水平驗(yàn)證Tet-On調(diào)控的、特異性表達(dá)BCR-ABI_，融合基因表達(dá)系統(tǒng)的有效性后，我們將bcr-Tet-On-tTS和TRE2-BCR-ABI，基因元件通過(guò)顯微注射的方法分別或共注射到ICR×C57BL/6雜交Fl代鼠的雄原核中，試圖制備Tet-On系統(tǒng)調(diào)控融合基因BCR-ABL表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。 轉(zhuǎn)基因整

5、合的鑒定是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的重要環(huán)節(jié)之一，聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等原因而成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物篩選的主要檢測(cè)方法之一。為了提高PCR法篩選BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)基因小鼠檢測(cè)的準(zhǔn)確性與可信度，我們從模板質(zhì)量、引物、Taq酶濃度、Mg2+濃度、退火溫度等方面對(duì)用于BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)基因小鼠初篩的PCR方法進(jìn)行優(yōu)化，努力提高PCR反應(yīng)的靈敏度與特異性。同時(shí)我們通過(guò)嚴(yán)格

6、操作規(guī)范，協(xié)同紫外照射等方法來(lái)避免環(huán)境污染。 在本研究中，我們?cè)?16只受體鼠中移植了2550個(gè)原核顯微注射卵，共出生小鼠212只，顯微注射的成功率為60.9％，小鼠出生率為8.3％。其中TRE2-BCR-ABL和bcr-Tet-On-tTS雙基因注射移卵1709個(gè)，出生小鼠37只，小鼠出生率為2.2％；TRE2-BCR-ABL單基因注射移卵281個(gè)，出生小鼠25只，小鼠出生率為8.9％；bcr-Tet-On-tTS單基因注射移

7、卵560個(gè)，出生小鼠150只，小鼠出生率為26.8％。我們對(duì)出生的轉(zhuǎn)基因小鼠采用優(yōu)化后的PCR方法進(jìn)行了初篩，結(jié)果篩選到三只BCR-ABL基因陽(yáng)性鼠，其中一只經(jīng)Southern blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其后代共有21只鼠，均未檢測(cè)到BCR-ABL基因整合的陽(yáng)性鼠。目前沒(méi)有篩選到轉(zhuǎn)pbcr-Tet-On-tTS基因陽(yáng)性的小鼠。 目前，我們正在積極地分析原因，以期能夠盡快獲得Tet-On系統(tǒng)調(diào)控融合基因BCR-ABL表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。