BCR-ABL(Breakpoint Cluster Region-Abelson Leukemia Virus)融合基因激酶區(qū)T315I突變質粒的構建.pdf

1、目的：構建BCR-ABL融合基因激酶區(qū)T315I突變型和野生型質粒。
　　方法：在我院確診的CML患者伊馬替尼治療后發(fā)生耐藥,經基因測序證實存在T315I點突變。1.取患者血液標本后通過分離白細胞提取RNA;2.應用第一鏈cDNA合成試劑盒對RNA逆轉錄獲得cDNA;3.針對T315I突變區(qū)域設計特定PCR引物,通過PCR反應大量擴增DNA;4、應用T4DNA連接酶將目標片段與pGEM-T質粒載體連接;5.應用細菌轉化技術將目標轉

2、入JM109感受態(tài)大腸桿菌,在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)大腸桿菌后在含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB平板上培養(yǎng);6.含有重組質粒的轉化子在具有生色誘導的培養(yǎng)基上只能形成白色菌落,通過藍白篩選挑選單克隆菌落;7.將挑取的單克隆菌落在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中增殖大量復制轉化質粒;8.用質粒抽取試劑盒提取培養(yǎng)后的菌液質粒;9.將對應菌落所得的菌落送生物測序公司,應用質粒測序技術檢測單克隆菌落轉化后質粒DNA序列;10.挑取存在T

3、315I點突變的質粒和野生型菌落再次培養(yǎng)后提取制備大量質粒。
　　結果：構建了單純發(fā)生BCR-ABL融合基因激酶區(qū)T315I突變和野生型的質粒,為后續(xù)試驗建立一種檢測BCR-ABL融合基因激酶區(qū)T315I突變的簡便的檢測方法提供基礎。
　　結論：隨著TKI治療CML患者發(fā)生耐藥突變增多,目前針對點突變的檢測方法主要為測序法,其檢測程序繁瑣,操作周期長,檢測費用高昂,另有些其他檢測方法仍因技術、設備等原因未實現(xiàn)普及。本實驗中在