CTP-OD-HA融合肽抑制BCR-ABL同源寡聚化逆轉(zhuǎn)CML細(xì)胞惡性表型.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）以具有強(qiáng)烈酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白的持續(xù)表達(dá)為重要特征。BCR-ABL癌蛋白能激活多條癌性信號通路，通過抑制細(xì)胞分化和凋亡，促進(jìn)增殖和異常黏附而導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，在CML的發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵性作用。針對BCR-ABL酪氨酸激酶活性的特異性小分子抑制劑如格列衛(wèi)、達(dá)沙替尼和尼洛替尼等的臨床應(yīng)用使CML治療獲得了很大進(jìn)展，但最終因不能清除CML惡性克

2、隆而導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)耐藥或復(fù)發(fā)，因此，急需進(jìn)一步探討CML治療新靶點(diǎn)。 BCR-ABL融合蛋白N端寡聚化區(qū)域（oligomerization domain，OD域）所介導(dǎo)的BCR-ABL同源寡聚化是BCR-ABL自身磷酸化導(dǎo)致分子構(gòu)型改變，并最終異常激活A(yù)bl酪氨酸激酶活性的關(guān)鍵因素。我們推測：通過轉(zhuǎn)導(dǎo)外源性O(shè)D域蛋白入CML細(xì)胞后干擾BCR-ABL寡聚化來抑制BCR-ABL酪氨酸激酶活化可成為CML治療的新切入點(diǎn)。但由于生物

3、大分子無法自動(dòng)穿越細(xì)胞膜和需要精確定位到特定亞細(xì)胞池中才能發(fā)揮功能等原因而使蛋白類藥物為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療策略受到極大限制。 胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽（Cytoplasmic transduction peptide，CTP）是一種新近報(bào)道的能攜帶蛋白類大分子穿越細(xì)胞膜并定位于細(xì)胞漿中的新型轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，非常適合于作為攜帶胞漿蛋白治療肽的穿膜系統(tǒng)。鑒于本研究中設(shè)計(jì)的OD域短肽擬在胞漿區(qū)發(fā)揮競爭性抑制胞漿蛋白BCR-ABL自身寡聚化的作用，CTP可成為合

4、適的OD域轉(zhuǎn)運(yùn)載體。 本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建、表達(dá)并純化具有胞漿定位活性的CTP-OD-HA融合肽（為便于后期的免疫學(xué)檢測而引入HA標(biāo)簽）的基礎(chǔ)上，以含有BCR-ABL融合基因的K562、KU812、BP210和DP210等各種CML細(xì)胞株為體外模型，以BP210-Babl/C CML小鼠為體內(nèi)模型，探討外源性CTP-OD-HA融合蛋白作用CML細(xì)胞及模型動(dòng)物后是否能通過抑制BCR-ABL同源寡聚化進(jìn)而抑制其酪氨酸激酶活性而對CML細(xì)胞生

5、長、增殖和凋亡產(chǎn)生影響，旨在探索一種新的CML分子靶向治療策略。采用的主要實(shí)驗(yàn)方法如下： 1.CTP-OD-HA融合蛋白的克隆構(gòu)建、原核表達(dá)、純化及生物學(xué)活性分析：通過次序嚴(yán)密的分步克隆，分別將OD、HA和CIP基因片段順次克隆入原核表達(dá)載體pET32a（+）中。進(jìn)行酶切與測序鑒定后，將構(gòu)建正確的pCTP-OD-HA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21（DE3）菌株，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)CTP-OD-HA融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物用SDS-P

6、AGE和western blot進(jìn)行鑒定；采用組氨酸親和層析法純化目的蛋白；經(jīng)脫鹽定量后進(jìn)行腸激酶切割、回收、FITC標(biāo)記，熒光顯微鏡檢測FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在CML細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；免疫細(xì)胞化學(xué)染色和激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入CML細(xì)胞后的亞細(xì)胞定位情況；Western blot進(jìn)一步分析CTP-OD-HA在各種CML細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；以期為進(jìn)一步探討CTP-OD-HA融合蛋白治療肽對CML的治療作用奠定實(shí)驗(yàn)

7、基礎(chǔ)。 2.觀察CTP-OD-HA融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)在CML細(xì)胞株中的特異性抑增殖、促凋亡等生物學(xué)效應(yīng)，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。 3.構(gòu)建BCR-AI3L轉(zhuǎn)化的BP210造血細(xì)胞株在等基因Balb/C小鼠體內(nèi)定殖的CML動(dòng)物模型，并對其血液學(xué)、臟器浸潤特征以及建模可重復(fù)性等方面進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證后，觀察CTP-OD-HA融合蛋白預(yù)轉(zhuǎn)導(dǎo)對CML模型動(dòng)物的保護(hù)作用。 通過以上實(shí)驗(yàn)，獲得如下主要結(jié)果和結(jié)論： 1.CTP-

8、OD-HA融合蛋白在37℃、1mM IPTG誘導(dǎo)4h的條件下獲得高效、可溶性表達(dá)；經(jīng)Ni-NTA親和純化獲得了高純度CTP-OD-HA融合蛋白；經(jīng)脫鹽、腸激酶切割和FITC標(biāo)記后證實(shí)了CTP-OD-HA融合蛋白在CML細(xì)胞中的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；免疫細(xì)胞化學(xué)染色和激光共聚焦顯微鏡觀察證實(shí)了CTP-OD-HA明顯的胞漿定位偏性；Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CTP-OD-HA在各種CML模型細(xì)胞中的高轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。由此可見，CTP-OD-

9、HA融合基因能在PET表達(dá)系統(tǒng)中以可溶性形式高效表達(dá)，重組蛋白CTP-OD-HA具有良好的生物學(xué)活性，為下一步研究CTP-OD-HA的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 2.純化的CTP-OD-HA融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)后在各種CML細(xì)胞株中表現(xiàn)出BCR-ABL特異性增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)；進(jìn)一步的機(jī)制研究證實(shí)：CTP-OD-HA轉(zhuǎn)導(dǎo)入CML細(xì)胞后能通過競爭性結(jié)合BCR-ABL癌蛋白而抑制其自身寡聚化和后續(xù)酪氨酸磷酸化，阻斷癌性酪氨酸激酶信號通路，并