線粒體mtDNA4977缺失突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構(gòu)建實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,為定量檢測人類線粒體DNA4977bp(mitochondrial DNA,mtDNA4977)缺失突變(簡稱普遍缺失)的拷貝數(shù),為探討線粒體mtDNA4977缺失突變與噪聲性耳聾的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
   方法:首先用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增人的線粒體mtDNA4977缺失片段CD、線粒體保守序列D-LOOP和人的管家基因GAPDH,瓊脂糖凝膠電泳,膠回收DNA,純化,

2、將其分別連接到PMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽性克隆株大量擴(kuò)增后提取質(zhì)粒,通過酶切和測序檢測目的片段的插入情況。同時(shí)對插入正確的的質(zhì)粒一系列倍比梯度稀釋進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測,通過其擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率等判斷評價(jià)構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
   結(jié)果:1.利用合成的引物擴(kuò)增出人線粒體mtDNA4977缺失片段CD、線粒體保守序列D-LOOP和人的管家基因GAPDH 2.將CD、D-LOOP和GAPDH三個目的片段分別

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