BCR-ABL融合基因陽(yáng)性B-ALL相關(guān)microRNAs篩選及其功能和作用機(jī)制初步研究.pdf

1、背景：
　　MicroRNAs(miRNAs)是長(zhǎng)度為20-22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，在真核生物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，通過(guò)與靶基因mRNA結(jié)合誘導(dǎo)其降解或阻遏翻譯過(guò)程以調(diào)控靶基因表達(dá)。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起著重要的作用，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程。miRNA還可以通過(guò)不同的調(diào)節(jié)途徑參與腫瘤的形成，其異常表達(dá)與人類(lèi)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái)研究也表明，miRNA不僅在調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞增殖、分化及凋亡過(guò)程中

2、起著重要作用，還參與了白血病的發(fā)生與發(fā)展。
　　急性淋巴細(xì)胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是起源于淋巴細(xì)胞系（前體 B、T或成熟 B淋巴細(xì)胞）的惡性克隆性疾病，是血液系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。兒童急性白血病中ALL約占80％，高發(fā)年齡段是2-5歲，成人急性白血病中ALL約占20%，高發(fā)年齡段是50歲以后，85%的兒童ALL與75%的成人ALL是B-ALL。隨著治療方案的不斷改善，B-ALL

3、的緩解率大大提高，兒童患者多數(shù)可以達(dá)到完全緩解。
　　BCR/ABL融合基因是由9號(hào)染色體上的原癌基因ABL，易位至22號(hào)染色體的BCR區(qū)，形成t(9;22)(q34;q11)，即BCR/ABL融合基因。它是B-ALL染色體異常的一種類(lèi)型，稱(chēng)為BCR/ABL融合基因陽(yáng)性的 B-ALL。盡管隨著新技術(shù)和新藥物等診斷和治療方法應(yīng)用于臨床，使得B-ALL的早期診斷和預(yù)后有了很大提高，但BCR/ABL融合基因陽(yáng)性的B-ALL患者完全緩解困

4、難或完全緩解后易復(fù)發(fā)，該類(lèi)患者預(yù)后差，死亡率高的情況仍未改善，3-5年的無(wú)病生存期（ disease-free survival，DFS）<10%，復(fù)發(fā)率高。因此針對(duì)BCR/ABL融合基因陽(yáng)性B-ALL致病機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，對(duì)其診療、預(yù)后判斷，甚至對(duì)靶向治療藥物的設(shè)計(jì)均有重要意義。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道參與BCR/ABL融合基因陽(yáng)性的B-ALL的發(fā)生發(fā)展的重要基因和通路，但大多數(shù)集中于編碼基因編碼蛋白質(zhì)的分子網(wǎng)絡(luò)研究，對(duì)于非編碼基因mi

5、RNAs參與該類(lèi)B-ALL的作用研究鮮見(jiàn)。
　　目的：
　　通過(guò)高通量深度測(cè)序及熒光定量PCR技術(shù)分析和發(fā)現(xiàn)BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL相關(guān)或特異miRNAs，初步明確其對(duì)該類(lèi)高危急性白血病的作用性質(zhì)；生物信息學(xué)分析和尋找這些miRNAs關(guān)系密切的靶基因，為BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL發(fā)生發(fā)展的致病機(jī)制研究，以及診斷、治療、預(yù)后分析提供理論基礎(chǔ)和新的思路。
　　方法：
　　共收集139例住院患者的骨髓標(biāo)本，其中初

6、診B-ALL患者68例為實(shí)驗(yàn)組；初診CML患者7例，初診APL患者11例為疾病對(duì)照組；正常對(duì)照組患者53例。通過(guò)多重巢式PCR結(jié)合細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)確診BCR/ABL陽(yáng)性或陰性B-ALL及其他白血病；流式細(xì)胞分選BCR/ABL陽(yáng)性及陰性B-ALL白血病細(xì)胞；提取總RNA，行miRNAs深度基因測(cè)序，篩選差異表達(dá)miRNAs；熒光定量PCR進(jìn)行大臨床樣本的進(jìn)一步驗(yàn)證和發(fā)現(xiàn)BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL相關(guān)miRNAs；選取部分B

7、CR/ABL陽(yáng)性B-ALL相關(guān)miRNAs，電轉(zhuǎn)染其模擬物至BCR/ABL陽(yáng)性及陰性B-ALL白血病細(xì)胞株，CCK-8檢測(cè)這些相關(guān)miRNAs對(duì)BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，明確其初步的生物學(xué)功能；生物信息學(xué)分析和尋找這些相關(guān)miRNAs的靶基因，分析和探討其與BCR/ABL融合基因及其他基因的調(diào)控作用和結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　1.BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL中存在差異性表達(dá)的miRNAs，這些miR

8、NAs在正常對(duì)照組及正常核型B-ALL中的表達(dá)水平亦存在差異。
　　2.BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL中差異性表達(dá)的miRNAs在不同類(lèi)型的白血病中的表達(dá)水平也存在差異。
　　3.miR-183、4485、5008、5582等相關(guān)miRNAs在BCR/ABL陽(yáng)性及陰性B-ALL細(xì)胞株中也存在差異性表達(dá)。
　　4.miR-183,4485、5008、5582等BCR/ABL陽(yáng)性 B-ALL相關(guān)miRNAs在BCR/ABL陽(yáng)

9、性B-ALL細(xì)胞株中的過(guò)表達(dá)可抑制BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL細(xì)胞增殖。
　　5.BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL相關(guān)miRNAs在BCR、ABL及BCR/ABL融合基因中可能存在直接作用靶點(diǎn)，從而直接或間接參與BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL的發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)論：
　　BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL存在低水平表達(dá)的miR-183、4485、5008、5582等miRNAs，這些BCR/ABL陽(yáng)性B-ALL相關(guān)的miRNAs可