Abl interactor蛋白在p185 Bcr-Abl轉(zhuǎn)化的白血病細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移需要經(jīng)歷一系列的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過程，其發(fā)生機(jī)制仍不甚清楚。研究表明，在這一過程中，癌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的異常動(dòng)態(tài)變化與癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力并最終導(dǎo)致癌癥發(fā)展惡化密切相關(guān)。近年來，越來越多的證據(jù)表明揭示非受體酪氨酸激酶結(jié)合蛋白Abi在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　 Abi蛋白家族最早因?yàn)槠涑蓡T能與原癌蛋白c-Ab1、v-Ab1和BCR-Ab1結(jié)合而被發(fā)現(xiàn)，研究證明Abi蛋白及其信號(hào)信號(hào)通路相關(guān)蛋白在癌細(xì)

2、胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，Dai實(shí)驗(yàn)室系列研究證明Abi1可以介導(dǎo)p185BCR-Ab1信號(hào)激活肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)因子WAVE2，從而在被轉(zhuǎn)化變成癌細(xì)胞的小鼠祖B細(xì)胞(pro-B-cell)BaF3細(xì)胞中形成異常的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)提高了細(xì)胞的異常移動(dòng)和黏附能力，并有助于在體內(nèi)環(huán)境中癌細(xì)胞侵入其它組織，其形式和作用類似侵入偽足，因此Abi蛋白可以通過對(duì)細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)的異常調(diào)控增強(qiáng)癌細(xì)胞侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力。但是對(duì)Abi蛋白及其調(diào)控的信號(hào)通路在各種癌細(xì)

3、胞的運(yùn)動(dòng)中所起的作用還有待于進(jìn)一步的研究，闡明Abi在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用機(jī)制對(duì)抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有重要意義。
　　 本論文的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.在造血癌細(xì)胞BaF3p185中首次實(shí)現(xiàn)了Abi2的重組表達(dá)
　　 已有的研究發(fā)現(xiàn)在致癌基因酪氨酸磷酸激酶p185 Bcr-Ab1轉(zhuǎn)化的癌變細(xì)胞中，Abi2蛋白表達(dá)下調(diào)甚至完全消失，并且證明這種表達(dá)量下調(diào)的原因是由Bcr-Ab1和Src酪氨酸激酶介導(dǎo)的翻譯后蛋白泛素化

4、修飾降解造成的。推測(cè)Abi2蛋白作為腫瘤抑制因子在白血病病理研究中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探索Abi2蛋白在癌變細(xì)胞中的功能，有必要首先實(shí)現(xiàn)Abi2蛋白在癌變細(xì)胞中的表達(dá)。通過對(duì)abi1和abi2 cDNA序列置換，構(gòu)建了融合質(zhì)粒pcDNA-Myc3-Abi2N1C1和pcDNA-Myc3-Abi2M1A。經(jīng)對(duì)白血病細(xì)胞的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及胞內(nèi)蛋白的分析檢測(cè)，結(jié)果證明，pcDNA-Myc3-Abi2M1A在BaF3p185wt細(xì)胞中可以產(chǎn)生融合蛋

5、白Abi2M1A，從而實(shí)現(xiàn)了Abi2在白血病細(xì)胞BaF3p185wt中的重新表達(dá)；同時(shí)證明了Abi2蛋白中間一段60個(gè)氨基酸序列對(duì)它的降解起重要作用。這一技術(shù)上的突破，為進(jìn)一步研究Abi2蛋白在Bcr-Ab1誘導(dǎo)的白血病發(fā)生過程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.首次闡明Abi2蛋白的兩種異形體Abi2A和Abi2B/A具有不同的功能
　　 Abi2A和Abi2B/A是由同一基因選擇性剪接而產(chǎn)生的的一類蛋白質(zhì)異形體。通過

6、蛋白序列同源性比對(duì)，首次發(fā)現(xiàn)Abi2A由于缺少WAB結(jié)構(gòu)域而不能和WAVE形成復(fù)合物(Abi/WAVE復(fù)合物在調(diào)解肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)中起重要作用)，而Abi1和Abi2B/A都可以和WAVE形成復(fù)合物參與調(diào)解細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)，這表明Abi2A具有與Abi1和Abi2B/A不同的調(diào)控功能。在乳腺癌細(xì)胞表達(dá)系MDA-MB231中，異源表達(dá)的Abi1和Abi2B/A可以提高基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9基因的表達(dá)，而Abi2A不具有這種功能，這種功能差

7、異的發(fā)現(xiàn)為研究Abi家族成員在腫瘤產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.首先發(fā)現(xiàn)參與癌細(xì)胞調(diào)控的Abi1和Abil蛋白在G2/M期可以被細(xì)胞周期依賴的磷酸激酶CDC2過度磷酸化。
　　 利用有絲分裂抑制劑Nocodazole將人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞同步在細(xì)胞周期的G2/M期，通過Western和體外磷酸化實(shí)驗(yàn)等手段分析證明Abi在細(xì)胞G2/M期受細(xì)胞周期依賴的磷酸化激酶CDC2調(diào)控，使其在細(xì)胞周期的G2/M期被過度

8、磷酸化，而隨著有絲分裂的結(jié)束，Abi又被去磷酸化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示Abi可能在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮特定的作用。
　　 4.利用乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231，探討和闡明了Abi1蛋白在腫瘤產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控作用
　　 (1)Abi1蛋白在乳腺癌細(xì)胞中聚集在侵入偽足處
　　 乳腺癌MDA-MB231細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移的情況下可以產(chǎn)生侵入偽足結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下表現(xiàn)為肌動(dòng)蛋白F-actin聚集的斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)(puncta)，并能

9、夠原位消化綠色熒光偶聯(lián)的明膠涂層。通過構(gòu)建表達(dá)GFP-Abi1融合蛋白的反轉(zhuǎn)錄病毒載體，并將該質(zhì)粒和表達(dá)GFP的對(duì)照質(zhì)粒分別導(dǎo)入到MDA-MB231細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下可觀察到GFP-Abi1在侵入偽足的F-actin斑點(diǎn)結(jié)構(gòu)處也呈點(diǎn)狀聚集分布。而轉(zhuǎn)化入GFP對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞中，GFP則分散分布于細(xì)胞內(nèi)，沒有顯示與侵入偽足的共定位現(xiàn)象。通過對(duì)cortactin的間接免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步檢測(cè)了Abi1與侵入偽足標(biāo)記分子cortacti

10、n共定位的關(guān)系，研究表明重組蛋白GFP-Abi1能夠與cortactin蛋白形成共定位關(guān)系。
　　 (2)Abi1基因沉默影響MI)A-MB231細(xì)胞侵入偽足的形成，降低MMP-9的表達(dá)并削弱其體外的ECM降解能力
　　 為進(jìn)一步證明Abi1在癌細(xì)胞MDA-MB231中侵入偽足形成中的作用，通過短發(fā)夾shRNA介導(dǎo)的基因沉默下調(diào)了Abi1的表達(dá)，Abi1基因沉默(Abi1 knock down，Abi1KD)的MDA-M

11、B231中侵入偽足的形成明顯減少。明膠酶譜(gelatinzymography)檢測(cè)MDA-MB231Abi1KD細(xì)胞的MMP表達(dá)分泌，結(jié)果顯示MDA-MB231Abi1KD細(xì)胞中MMP-9的分泌明顯少于對(duì)照MDA-MB231細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)實(shí)驗(yàn)顯示MDA-MB231Abi1KD細(xì)胞降解熒光標(biāo)記的明膠涂層的能力受到了明顯的削弱，說明Abi1的下調(diào)使MDA-MB231細(xì)胞體外降解ECM成分的能力降低。
　　 (3)Abi

12、1表達(dá)下調(diào)抑制Src的激活及ID1的表達(dá)
　　 已有的研究證實(shí)了酪氨酸激酶Src的激活在MDA-MB231細(xì)胞的侵入偽足形成的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。在本研究中，通過對(duì)處于激活狀態(tài)的Src(第416位酪氨酸被磷酸化的Src分子)的Western分析，在MDA-MB231Abi1KD細(xì)胞中Src活性明顯降低，用Src的抑制劑PP2對(duì)MDA-MB231細(xì)胞進(jìn)行了處理，PP2的處理使MDA-MB231細(xì)胞侵入偽足的形成受到了明顯抑制。結(jié)合

13、Abi1的下調(diào)也可以降低細(xì)胞侵入偽足的形成，可以推測(cè)Abi1的下調(diào)可能是通過導(dǎo)致對(duì)Src激活的抑制，來影響侵入偽足的形成的。研究結(jié)果還顯示，Abi1基因的沉默還可以降低細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物ID1蛋白的表達(dá)。
　　 (4)Abi1的表達(dá)下調(diào)抑制了MDA-MB231細(xì)胞的移動(dòng)和侵潤(rùn)
　　 為了進(jìn)一步證明Abi對(duì)癌細(xì)胞的調(diào)控作用，我們?cè)贜OD/SCID小鼠中使用了腎臟包膜下腫瘤細(xì)胞移植模型來評(píng)價(jià)Abi表達(dá)的下調(diào)能否影響MDA-

14、MB231細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)器官的侵潤(rùn)。研究結(jié)果表明，在移植六周之后，被植入左腎的MDA-MB231對(duì)照細(xì)胞長(zhǎng)成了非常明顯的腫瘤，充滿腫瘤組織的左腎與作為對(duì)照的右腎的平均重量比值為4.16。與此對(duì)比明顯的是，接種相同數(shù)量的MDA-MB231Abi1KD細(xì)胞只在其植入的左腎中長(zhǎng)成了有限體積的腫瘤組織，帶瘤腎與正常右腎的的平均重量比僅為1.13，說明MDA-MB231Abi1KD細(xì)胞在體內(nèi)形成的腫瘤顯著小于MDA-MB231對(duì)照細(xì)胞形成的腫瘤。對(duì)