bcr-abl逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小鼠慢性粒細(xì)胞白血病樣模型的建立.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種起源于異常多能造血干細(xì)胞的克隆增殖性疾病，bcr/abl融合基因的持續(xù)表達(dá)在該病的形成過(guò)程中起重要作用。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)CML發(fā)病機(jī)制和治療的研究主要選用含有bcr/abl融合基因的體外細(xì)胞模型、bcr/abl轉(zhuǎn)化的造血細(xì)胞株在小鼠體內(nèi)的定殖模型或K562細(xì)胞移植裸鼠成皮下瘤后，再接種到免疫缺陷小鼠建立CML模型鼠的方法。而利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小鼠骨髓轉(zhuǎn)導(dǎo)、移

2、植模型研究人類CML的發(fā)生、發(fā)展及其生物學(xué)特性，是20世紀(jì)90年代以來(lái)國(guó)外該領(lǐng)域研究的新進(jìn)展。 國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本課題以bcr/ab逆轉(zhuǎn)錄病毒Mig210為載體，經(jīng)包裝細(xì)胞包裝后收集病毒上清并測(cè)定滴度，感染經(jīng)5-FU預(yù)處理的Balb/c雄性小鼠骨髓細(xì)胞，再回輸?shù)浇?jīng)致死劑量γ射線照射后的同種雌性受體鼠中，首次成功建立了CML小鼠移植模型。并在此基礎(chǔ)上又建立了再次移植模型。其主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下： 1.bcr/ab逆

3、轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的慢性粒細(xì)胞白血病樣小鼠模型的首次建立。 含bcr/abl癌基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒Mig210載體經(jīng)Phoenix-Ampo細(xì)胞包裝后，收集病毒上清液并測(cè)定其滴度后感染經(jīng)5-FU預(yù)處理的Balb/c雄性小鼠骨髓細(xì)胞，再經(jīng)尾靜脈移植入經(jīng)致死劑量γ射線(900cGy)照射的同種雌性受體鼠中后，通過(guò)外周血和骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、肝臟和脾臟組織學(xué)觀察,RT-PCR和western blot分別檢測(cè) bcr/abl在mRNA和蛋白水平的表

4、達(dá)情況，鑒定小鼠成模狀況。移植8～9周后，外周血白細(xì)胞達(dá)(20～30)×1010/L(為對(duì)照鼠的5～8倍)，外周血涂片幼稚細(xì)胞達(dá)到10％～20％；骨髓粒系細(xì)胞顯著增高，易見(jiàn)幼稚細(xì)胞，肝脾也可見(jiàn)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)；移植4～5周后在受體鼠骨髓和脾臟檢出bcr/abl融合基因,8～9周后在肝臟檢測(cè)出bcr/abl融合基因，同時(shí)在骨髓和脾臟也檢測(cè)到BCR/ABL融合蛋白，建模成功的小鼠3～5月后相繼死亡。 為了提高CML成模率，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中

5、還優(yōu)化和改進(jìn)了方法：用纖維連接蛋白作基質(zhì)進(jìn)行病毒上清和骨髓細(xì)胞的共感染，使活細(xì)胞增加20％～30％，且更易附著于瓶底，細(xì)胞狀態(tài)也更好；用2mg～10mg/10g的5-FU預(yù)處理雄性供體Balb/c小鼠，對(duì)小鼠骨髓原始細(xì)胞相對(duì)數(shù)量無(wú)明顯性影響；回輸給受體鼠感染了病毒的骨髓細(xì)胞數(shù)量分別為0.2×106個(gè)、0.4×106個(gè)、0.6×106個(gè)和1.0×106個(gè)時(shí)，小鼠CML成模率分別為60％、80％、90％和90％。 2.bcr/ab1

6、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小鼠CML二次移植模型的建立。 收集成功建模的CML小鼠模型的骨髓細(xì)胞或脾細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈輸入經(jīng)亞致死劑量γ射線(450cGy)照射的同種雌性受體鼠中，通過(guò)脾集落形成實(shí)驗(yàn)、骨髓形態(tài)學(xué)觀察、Y染色體及其特異性性別決定基因Sry檢測(cè)、bcr/ab1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，分析鑒定CML小鼠二次移植模型成模情況。結(jié)果顯示：移植后12天，肉眼可見(jiàn)明顯的脾結(jié)節(jié)形成，連續(xù)切片可見(jiàn)成堆脾集落；移植4～5周后，在雌性受體小

7、鼠骨髓中檢出相似Y染色體及Y染色體特異性Sry基因，骨髓和脾臟中檢出bcr/abl融合基因；移植6～8周后外周血白細(xì)胞升高至正常未處理小鼠的4～8倍，粒系明顯增高至20～32×109個(gè)/L；外周血涂片幼稚細(xì)胞達(dá)10％～20％；骨髓涂片結(jié)果顯示粒系顯著增高，易見(jiàn)幼稚細(xì)胞，肝脾也可見(jiàn)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)，在肝臟檢測(cè)出bcr/abl融合基因；骨髓檢測(cè)到BCR/ABL融合蛋白的表達(dá)；移植后18周后，外周血涂片幼稚細(xì)胞30％以上，小鼠發(fā)生急變，最