禽白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的研究.pdf

1、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上6個特異區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶,在等溫條件下(63℃～65℃)可高效、快速、高特異地擴增靶序列。本研究針對ALV的gag基因設(shè)計引物,篩選禽白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法特異性引物、優(yōu)化禽白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法的條件,建立禽白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法(ALVRT-LAMP),并研究RT-LAMP方法用于臨床檢測ALV的可行性,為ALV的

2、快速診斷、病原監(jiān)測及分子流行病學(xué)調(diào)查提供有力工具。
　　 本研究針對ALVgag基因保守區(qū)設(shè)計合成的4套ALVRT-LAMP特異性引物,對雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生征病毒(REV)、雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞產(chǎn)蛋下降綜合征病毒(EDSV)、禽流感病毒(AIV)等病原核酸擴增結(jié)果均為陰性。以其中一套特異性引物為反應(yīng)引物,ALVRAV-1毒株為試驗?zāi)０鍖LVRT-LAMP反

3、應(yīng)體系的Betaine、Mg2+、dNTP、BstDNA大片段聚合酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、引物等反應(yīng)試劑的用量及溫度、時間等反應(yīng)條件進行了優(yōu)化,確定了最佳反應(yīng)體系。ALVRT-LAMP擴增結(jié)果通過直接觀察擴增產(chǎn)物的濁度、凝膠電泳觀察斑馬樣條帶的生成、熒光檢測法及實時渾濁儀檢測LAMP反應(yīng)四種方式進行判定,尤以LAMP方法特征性結(jié)果判定方式直接觀察擴增產(chǎn)物濁度最為簡單便捷。初步建立了ALVRT-LAMP方法。
　　 ALVRT-LAM

4、P敏感性試驗結(jié)果顯示,RT-LAMP方法能夠檢測0.2TCID50/0.1mL禽白血病病毒或1pg病毒核酸,且與ELISA方法、PCR方法比較,RT-LAMP方法敏感性更高。ALVRT-LAMP特異性試驗的酶切鑒定和測序結(jié)果均與理論結(jié)果相符,表明RT-LAMP方法可以特異性擴增ALV。且60分鐘內(nèi)便可完成擴增反應(yīng)。本研究成功建立了ALVRT-LAMP方法。
　　 將建立的ALVRT-LAMP方法對60批禽用活疫苗進行了禽白血病病