逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)人星狀病毒1型.pdf

1、研究背景：
　　 人星狀病毒(Human Astrovirus,HAstV)首次于1975年由Appleton和Higgins用電鏡檢測(cè)胃腸炎患兒糞便標(biāo)本時(shí)發(fā)現(xiàn)。星狀病毒屬單獨(dú)的星狀病毒科,星狀病毒屬,無(wú)衣殼單股正鏈RNA病毒。病毒顆粒直徑約28 nm,由于電鏡下病毒顆粒呈星形,因此被Madeley和Cosgrove命名為星狀病毒。病毒基因全長(zhǎng)618 kb,包含有三個(gè)開放閱讀框架(open reading frames):ORF

2、1a、ORF1b、ORF2。ORF1a、ORF1b在5'端,為高度保守區(qū)域,主要編碼蛋白酶及RNA多聚糖；ORF2在3'端,基因長(zhǎng)度為2388 kb,為多變區(qū),該區(qū)域主要編碼衣殼蛋白；此外,基因組還包括一個(gè)5'非編碼區(qū)與一個(gè)3'端非編碼區(qū)及一個(gè)約30個(gè)核苷酸的多聚核苷酸尾。
　　 HAstV是引起嬰幼兒腹瀉的最主要的病原之一,對(duì)志愿者和自然感染者的研究均證實(shí)它與腹瀉密切相關(guān)。世界各地均已有HAstV感染的報(bào)道,既可散發(fā)也可以引起

3、暴發(fā)流行,亦可引起醫(yī)源性感染。與輪狀病毒相似,HAstV感染多發(fā)生在2歲以內(nèi)尤其是1歲以內(nèi)的嬰幼兒。住院腹瀉患兒中HAstV檢出率為2.5％～9.0％,目前被認(rèn)為是嬰幼兒病毒性胃腸炎的第二位病因,僅次于輪狀病毒。此外,老年人和免疫缺陷患者也是HAstV感染的高危人群,人類免疫缺陷病毒感染者、接受骨髓移植及聯(lián)合免疫缺陷患者發(fā)生該病毒感染均已有報(bào)道。HAstV亦是健康成年人發(fā)生胃腸炎的病因之一。
　　 應(yīng)用多克隆抗體和單克隆抗體,可

4、將HAstV劃分為8個(gè)血清型。HAstV廣泛分布于世界各地,各血清型流行情況因地區(qū)和流行年不同而有所不同,其中多以血清型1型為主。HAstV感染具有較明顯的季節(jié)性,一般在溫帶地區(qū)的流行季節(jié)為冬季,而在熱帶地區(qū)的流行季節(jié)則為雨季。HAstV血清流行病學(xué)的研究顯示,5歲兒童抗1型HAstV的IgG抗體陽(yáng)性率達(dá)90％,說(shuō)明兒童5歲以前對(duì)HAstV已有廣泛的接觸。人們先后從貓、羊、豬等動(dòng)物糞便中及淤泥、湖水中分離出了星狀病毒,Miossee報(bào)道

5、曾從甲殼類水生物中分離出該病毒,提示星狀病毒有可能像甲型肝炎病毒一樣通過(guò)甲殼類水生物傳播。
　　 簡(jiǎn)便、快速地檢測(cè)HAstV,一直是人們研究的課題。目前檢測(cè)HAstV常用的方法有:1.電鏡法(electronic microscope):Appleton等于1975年首次用電鏡發(fā)現(xiàn)了HAstV,此后十多年時(shí)間里,電鏡是檢測(cè)該病毒的主要方法。此方法形象、直觀,但僅有10％的星狀病毒具有典型的星形外觀,故敏感性較低。若在標(biāo)本中加入熒

6、光標(biāo)記的抗體,可提高檢出率,稱為免疫電鏡法。當(dāng)病毒滴度低時(shí),免疫電鏡法仍有較高的假陰性,且由于價(jià)格昂貴,技術(shù)條件要求高,不適合大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。2.細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)和病毒分離(virus separate):1977年Lee和Kurtz采用人胚腎細(xì)胞成功分離了HAstV。1990年Willcocks等采用傳代細(xì)胞系人類結(jié)腸癌細(xì)胞(CaCo-2)直接從腹瀉標(biāo)本中分離出HAstV,且HAstV于CaCo-2細(xì)胞內(nèi)增殖

7、良好,這使HAstV的檢測(cè)方法發(fā)生了里程碑的進(jìn)步。人們可利用增殖的病毒制備不同血清型的單克隆抗體,這為以后應(yīng)用酶免疫法進(jìn)行大量流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ),正因?yàn)槿绱?星狀病毒腹瀉才逐漸為大家所認(rèn)識(shí)和重視。3.酶免疫法(enzyme immunoassay,EIA)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):Herrmand等在成功制備HAstV單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了EIA和ELIS

8、A,該法操作更簡(jiǎn)單,具有更好的敏感性及特異性,并能進(jìn)行分型。但用于檢測(cè)的單克隆抗體在商業(yè)上往往很難獲得且價(jià)格昂貴,故作為常規(guī)檢測(cè)方法在目前有較大的困難。4.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):隨著對(duì)星狀病毒培養(yǎng)、分離及測(cè)序的成功,星狀病毒的RT-PCR檢測(cè)法也就應(yīng)運(yùn)而生。從1993年開始,RT-PCR就應(yīng)用于檢測(cè)星狀病毒,并與EIA進(jìn)行了對(duì)比,發(fā)現(xiàn)RT-PCR法比EIA有更高的敏感性及特異性,不受難以獲得的血清抗體的限制,故目前大多數(shù)

9、星狀病毒的報(bào)道均是用該法進(jìn)行研究。5.血清學(xué)檢測(cè):HAstV血清學(xué)檢測(cè)方法包括免疫電鏡(IEM)、放射免疫法(RIA)、免疫熒光法(IFA)、酶免疫法(EIA)等。血清學(xué)檢測(cè)方法可幫助了解HAstV感染狀況,目前認(rèn)為其特異性抗體僅具有部分保護(hù)作用,故現(xiàn)在開展得較少。
　　 LAMP法利用酶反應(yīng)系統(tǒng)直接擴(kuò)增靶核酸序列,能使靶核酸序列呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增,在45～60min的時(shí)間里可達(dá)到109～1010數(shù)量級(jí):反應(yīng)過(guò)程不需控制溫度的變化,在

10、恒溫水浴加熱即可進(jìn)行,省去了昂貴的熱循環(huán)儀的費(fèi)用。由于兩對(duì)引物在靶基因上的6個(gè)不同部位完全匹配才能進(jìn)行擴(kuò)增,所以LAMP法具有很高的特異性。在DNA合成時(shí),從脫氧核酸三磷酸基質(zhì)(dNTP)中析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng),產(chǎn)生大量焦磷酸鎂白色沉淀,因此可以把渾濁度作為反應(yīng)的指標(biāo),僅用肉眼觀察白色渾濁沉淀就能鑒定擴(kuò)增與否,而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。有時(shí),通過(guò)肉眼觀察白色沉淀來(lái)判斷會(huì)存在一定的誤差,日本榮研株式會(huì)社利用LAM

11、P反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生焦磷酸鎂白色沉淀,研制出專門用于LAMP檢測(cè)的實(shí)時(shí)濁度儀,以實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP擴(kuò)增過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控,使擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)完成。此外,還可通過(guò)添加熒光染料,如溴化乙錠(EB)、SYBR GreenⅠ等進(jìn)行染色,來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增是否發(fā)生。LAMP反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物是分子量大小不等的莖環(huán)DNA組成的混合物,在2％的瓊脂糖凝膠上電泳呈現(xiàn)的是典型的梯狀條帶。LAMP法由于具有操作簡(jiǎn)便易行、特異性高、結(jié)果判斷簡(jiǎn)單等多方面的優(yōu)點(diǎn),故本法一經(jīng)面世就被應(yīng)

12、用到很多方面,包括人類、動(dòng)物和植物致病微生物的檢測(cè)、動(dòng)物胚胎性別的鑒別和轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)等。
　　 研究目的：
　　 建立一種快速檢測(cè)人星狀病毒Ⅰ型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法。
　　 研究方法
　　 1.標(biāo)本的收集
　　 1份HAstV-1型和1份札幌病毒GⅡ型陽(yáng)性糞便標(biāo)本來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所,2份諾如病毒GⅡ型、3份輪狀病毒A組陽(yáng)性糞便標(biāo)本由本實(shí)驗(yàn)室保存,80份腹瀉患者糞便標(biāo)本于

13、2006年8月至2007年1月期間收集于江門市婦幼保健醫(yī)院兒科門診,以及江門市人民醫(yī)院急診科和腹瀉門診。收集的糞便標(biāo)本用PH7.2的PBS配制成懸液保存于-40℃。
　　 2.引物設(shè)計(jì)
　　 針對(duì)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因組保守區(qū)域ORF1a,通過(guò)ClustalW2在線軟件比對(duì)GeneBank上已公布的ORF1a序列確定LAMP目標(biāo)序列,輸入在線軟件PrimerExplorer V4設(shè)計(jì)出特異的RT-LAMP引物,其序列(5'

14、-3')為:F3:GCATTATCTTCTTGTGCTTCA；B3:TCACGGATCTCGAACCTG；FIP:CCACCAGCAATTAATACTGCTGTAGGAAGACTCCAACTATGTGAGC;BIP:GCACGACCACGTCATTGTTTCAATGAAAACAGTTGCCATAC。
　　 3.RNA的提取
　　 用Trizol法從收集的糞便標(biāo)本提取RNA并溶于DEPC處理水,測(cè)定其230nm、260nm

15、、280nm和310nm的OD值,保存于-80℃。
　　 4.RT-LAMP條件優(yōu)化、產(chǎn)物的檢測(cè)和酶切鑒定
　　 反應(yīng)體系置60℃恒溫反應(yīng)45min、60min、75min、90min,最后80℃孵育5min以滅活酶終止反應(yīng)。產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳后溴化乙錠染色紫外線下觀察,以及熒光染料SYBR Green Ⅰ染色后肉眼觀察。對(duì)RT-LAMP產(chǎn)物進(jìn)行切膠、稱重,經(jīng)凝膠回收試劑盒純化回收后用限制性內(nèi)切酶TaaI進(jìn)行切割,凝膠電泳

16、觀察酶切片段。
　　 5.RT-PCR和RT-LAMP檢測(cè)HAstV-1型的特異性、敏感性分析
　　 5.1 以RT-LAMP的外引物F3、B3作為RT-PCR的上、下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行切膠、稱重,經(jīng)凝膠回收試劑盒純化回收后,與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α。通過(guò)藍(lán)白斑篩選試驗(yàn)挑出白色菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng),再提取質(zhì)粒DNA作模板用引物F3、B3進(jìn)行PCR擴(kuò)

17、增來(lái)鑒定篩選正確的克隆。測(cè)定質(zhì)粒溶液230nm、260nm、280nm和310 nm的OD值,將濃度為2.3x108copies/μl質(zhì)粒DNA溶液保存于-20℃?zhèn)溆谩?br>　　 5.21份HAstV-1型、1份札幌病毒GⅡ型、2份諾如病毒GⅡ型、3份輪狀病毒A組陽(yáng)性糞便標(biāo)本作為檢測(cè)對(duì)象,提取RNA同時(shí)進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)。
　　 5.3 HAstV-1型陽(yáng)性標(biāo)本所提取RNA的一系列稀釋度為:lng/μl,1

18、00pg/μl,10pg/μl,lpg/μl,100fg/μl,10fg/μl,分別作模板用RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)。
　　 5.4質(zhì)粒DNA濃度按10×梯度稀釋,其濃度為2.3x107copies/μl到23copies/μl,并作模板用LAMP和PCR檢測(cè)。
　　 6.檢測(cè)臨床腹瀉患者糞便標(biāo)本
　　 80份非細(xì)菌性腹瀉患者糞便標(biāo)本提取RNA后,同時(shí)用RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)。
　　 結(jié)