應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)柑橘潰瘍病菌.pdf_第1頁
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1、柑桔潰瘍病(CBCD)是嚴(yán)重危害世界柑桔種植業(yè)的一種細(xì)菌性病害,其病原物為地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種Xanthomonas axonopodis pv.citri(Xac)。CBCD廣泛發(fā)生在世界各主要柑桔產(chǎn)區(qū),包括亞洲、中東、非洲、太平洋和印度洋諸島、澳大利亞、南美以及美國(guó)東南部的三十多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有不同程度的發(fā)生。我國(guó)的CBCD主要分布在福建、廣東、廣西、江西、浙江、湖南、湖北以及云、貴、川等南方柑桔種植區(qū)。該病能侵染絕大多數(shù)商

2、品化栽培品種,雖然很少會(huì)直接殺死寄主,但會(huì)導(dǎo)致落葉、落果、樹勢(shì)衰弱和果實(shí)生銹斑且品質(zhì)變劣,嚴(yán)重降低了果品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
   長(zhǎng)期以來由于缺乏抗病品種和特效的化學(xué)防治藥劑,對(duì)該病的防治主要采取加強(qiáng)非疫區(qū)建設(shè)與植物檢疫來嚴(yán)防病害的傳播,對(duì)病樹采取挖除并集中燒毀的根除措施。柑桔非疫區(qū)建設(shè)的疫情監(jiān)測(cè)和柑桔苗木、果品出入境檢疫檢驗(yàn)要求快速準(zhǔn)確的診斷鑒定技術(shù)為支撐。
   植物疫害生物的檢測(cè)方法很多,包括癥狀目測(cè)法、病原菌分離培養(yǎng)及

3、致病性測(cè)定法、噬菌體檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、斑點(diǎn)免疫結(jié)合法(DIA)、DNA雜交診斷法、DNA指紋圖譜分析、PCR檢測(cè)技術(shù)等,特別是常規(guī)PCR技術(shù)和熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用使植物疫害生物的檢驗(yàn)檢疫工作有了一種更加快速、準(zhǔn)確、靈敏、便捷的檢測(cè)方法。黃冠軍建立了柑橘潰瘍病菌的滾環(huán)擴(kuò)增(RollingCircleAmplification,RCA)檢測(cè)體系,RCA是一種恒溫檢測(cè)技術(shù),不需要昂貴的PCR反應(yīng)儀,并且能夠?qū)Χ喟袠?biāo)

4、進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)避免了雙重PCR及多重PCR進(jìn)行多靶標(biāo)檢測(cè)時(shí)不同引物對(duì)之間的競(jìng)爭(zhēng)和相互抑制常常影響到檢測(cè)的特異性和穩(wěn)定性導(dǎo)致檢測(cè)體系不易優(yōu)化的缺點(diǎn)。但RCA的步驟包括探針的環(huán)化、線性模板的消化以及滾環(huán)擴(kuò)增,探針的環(huán)化通常采用熱循環(huán)連接法,因此它并不是一種嚴(yán)格意義上的等溫?cái)U(kuò)增,而且操作步驟較多,不適合向基層檢驗(yàn)檢疫部門推廣。LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)是Notomi在2000年發(fā)明

5、的一種新的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),它靈敏度高,能達(dá)到比常規(guī)PCR低一個(gè)數(shù)量級(jí)的檢測(cè)水平,同時(shí)針對(duì)靶序列六個(gè)特異性區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì),因此具有比常規(guī)PCR更高的特異性。相比于常規(guī)PCR與熒光定量PCR,LAMP和RCA都屬于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),即整個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在恒溫下進(jìn)行。但不同于RCA,LAMP的操作步驟更為簡(jiǎn)單,所有步驟均可在水浴鍋或其它恒溫設(shè)備中進(jìn)行,且反應(yīng)時(shí)間僅需一小時(shí)。LAMP技術(shù)的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)使其能很好的應(yīng)用于基層檢驗(yàn)檢疫部門,提高基層檢驗(yàn)檢疫的效

6、率及可靠性。
   本研究根據(jù)設(shè)計(jì)的LAMP檢測(cè)特異性引物建立并優(yōu)化了柑桔潰瘍病菌LAMP檢測(cè)體系,該體系能夠特異性地檢出Xac的菌體細(xì)胞及其DNA,而檢測(cè)不出供試的其它植物病原細(xì)菌和柑桔葉片表面常見的多種附生細(xì)菌,特異性檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR相同;對(duì)Xac基因組DNA的檢測(cè)靈敏度為2pg,對(duì)Xac菌懸液的檢測(cè)靈敏度為20 cfu/μL,比常規(guī)PCR的檢測(cè)靈敏度稍高。本試驗(yàn)成功地建立了柑橘潰瘍病菌的實(shí)驗(yàn)室LAMP檢測(cè)體系,通過對(duì)實(shí)

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