應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測柑橘潰瘍病菌.pdf

1、柑桔潰瘍病(CBCD)是嚴重危害世界柑桔種植業(yè)的一種細菌性病害，其病原物為地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種Xanthomonas axonopodis pv.citri(Xac)。CBCD廣泛發(fā)生在世界各主要柑桔產(chǎn)區(qū)，包括亞洲、中東、非洲、太平洋和印度洋諸島、澳大利亞、南美以及美國東南部的三十多個國家和地區(qū)均有不同程度的發(fā)生。我國的CBCD主要分布在福建、廣東、廣西、江西、浙江、湖南、湖北以及云、貴、川等南方柑桔種植區(qū)。該病能侵染絕大多數(shù)商

2、品化栽培品種，雖然很少會直接殺死寄主，但會導(dǎo)致落葉、落果、樹勢衰弱和果實生銹斑且品質(zhì)變劣，嚴重降低了果品的經(jīng)濟價值。
　　 長期以來由于缺乏抗病品種和特效的化學(xué)防治藥劑，對該病的防治主要采取加強非疫區(qū)建設(shè)與植物檢疫來嚴防病害的傳播，對病樹采取挖除并集中燒毀的根除措施。柑桔非疫區(qū)建設(shè)的疫情監(jiān)測和柑桔苗木、果品出入境檢疫檢驗要求快速準(zhǔn)確的診斷鑒定技術(shù)為支撐。
　　 植物疫害生物的檢測方法很多，包括癥狀目測法、病原菌分離培養(yǎng)及

3、致病性測定法、噬菌體檢測法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、斑點免疫結(jié)合法(DIA)、DNA雜交診斷法、DNA指紋圖譜分析、PCR檢測技術(shù)等，特別是常規(guī)PCR技術(shù)和熒光定量PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用使植物疫害生物的檢驗檢疫工作有了一種更加快速、準(zhǔn)確、靈敏、便捷的檢測方法。黃冠軍建立了柑橘潰瘍病菌的滾環(huán)擴增(RollingCircleAmplification，RCA)檢測體系，RCA是一種恒溫檢測技術(shù)，不需要昂貴的PCR反應(yīng)儀，并且能夠?qū)Χ喟袠?biāo)

4、進行檢測，同時避免了雙重PCR及多重PCR進行多靶標(biāo)檢測時不同引物對之間的競爭和相互抑制常常影響到檢測的特異性和穩(wěn)定性導(dǎo)致檢測體系不易優(yōu)化的缺點。但RCA的步驟包括探針的環(huán)化、線性模板的消化以及滾環(huán)擴增，探針的環(huán)化通常采用熱循環(huán)連接法，因此它并不是一種嚴格意義上的等溫擴增，而且操作步驟較多，不適合向基層檢驗檢疫部門推廣。LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)是Notomi在2000年發(fā)明

5、的一種新的恒溫擴增技術(shù)，它靈敏度高，能達到比常規(guī)PCR低一個數(shù)量級的檢測水平，同時針對靶序列六個特異性區(qū)域進行引物設(shè)計，因此具有比常規(guī)PCR更高的特異性。相比于常規(guī)PCR與熒光定量PCR，LAMP和RCA都屬于恒溫擴增技術(shù)，即整個擴增反應(yīng)在恒溫下進行。但不同于RCA，LAMP的操作步驟更為簡單，所有步驟均可在水浴鍋或其它恒溫設(shè)備中進行，且反應(yīng)時間僅需一小時。LAMP技術(shù)的特點及優(yōu)勢使其能很好的應(yīng)用于基層檢驗檢疫部門，提高基層檢驗檢疫的效

6、率及可靠性。
　　 本研究根據(jù)設(shè)計的LAMP檢測特異性引物建立并優(yōu)化了柑桔潰瘍病菌LAMP檢測體系，該體系能夠特異性地檢出Xac的菌體細胞及其DNA，而檢測不出供試的其它植物病原細菌和柑桔葉片表面常見的多種附生細菌，特異性檢測結(jié)果與常規(guī)PCR相同;對Xac基因組DNA的檢測靈敏度為2pg，對Xac菌懸液的檢測靈敏度為20 cfu/μL，比常規(guī)PCR的檢測靈敏度稍高。本試驗成功地建立了柑橘潰瘍病菌的實驗室LAMP檢測體系，通過對實