柑橘潰瘍病菌重組單鏈抗體研究.pdf

1、基因工程重組單克隆抗體(recombination monoclonal antibody，RMA)是90年代以來，人們利用基因工程重組技術(shù)，有目的地在基因水平上對抗體分子進行切割、拼接或修飾，或者直接合成基因序列，再將重組DNA或重組蛋白基因?qū)爰毎磉_產(chǎn)生的一類抗體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)特點與單克隆抗體相同，具有穩(wěn)定的免疫特異性。其中單鏈抗體(singe chain variable fragment，ScFv)由于低或無免疫原性、分子量小、

2、組織穿透力強，成本低，可大規(guī)模生產(chǎn)等特點已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。單鏈抗體可以通過噬菌體展示技術(shù)或核糖體展示技術(shù)加以制備。其中，核糖體展示技術(shù)完全在體外進行，其庫容量遠遠大于噬菌體展示文庫，此外核糖體展示技術(shù)簡便的建庫和篩選方法，勿需選擇壓力，通過引入突變和重組技術(shù)來提高靶標(biāo)蛋白的親和力等優(yōu)點都使核糖體展示技術(shù)顯示出了誘人的發(fā)展前景。 國內(nèi)外關(guān)于植物病原菌重組抗體的研究鮮見報道。只有少數(shù)應(yīng)用噬菌體展示文庫篩選了幾種植物病原菌單鏈抗體

3、，并將其應(yīng)用于診斷研究中。至今無應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選植物病原菌單鏈重組抗體的報道。柑桔潰瘍病(citrus bacterial canker disease，CBCD)是影響全球柑桔種植業(yè)發(fā)展的重大檢疫性病害，其病原菌為地毯草黃單胞柑桔致病變種 (Xanthomonas axonopodis pv．citri)，是國內(nèi)外重大檢疫性有害生物。因抗病品種和特效藥劑缺乏，美國、巴西等主要柑桔種植大國對柑桔潰瘍病仍然沿用挖除病樹集中燒毀的根除

4、方法。目前我國正在實施的柑桔非疫生產(chǎn)區(qū)建設(shè)，強化植物檢疫，嚴防疫害傳入的監(jiān)控策略，都迫切需要建立快速、特異、準(zhǔn)確的診斷技術(shù)及防控措施。柑橘黃單孢菌 (Xac) 其細胞外有一層脂多糖(LPS)，其有助于菌體吸附和吸收養(yǎng)分，增強病菌的抗逆能力，已經(jīng)證實這些胞外多糖和糖蛋白是影響寄主與病原物接觸識別或抑制識別和致病的生化因子。在病原菌與寄主表面接觸時，識別作用決定了寄主一病原物互作性質(zhì)。LPS 由類脂A、核心多糖和O特異性多糖側(cè)鏈(O特異性L

5、PS)組成。其中O特異性LPS決定病原菌的種屬特異性。 本研究應(yīng)用核糖體展示技術(shù)建立抗柑橘潰瘍病菌單鏈抗體文庫，用 O 特異性LPS 作為抗原篩選特異于柑橘潰瘍病菌的單鏈抗體，并將篩選的單鏈抗體進行表達、純化、研究其親和力及特異性。本研究篩選的單鏈抗體可為柑橘潰瘍病菌的血清學(xué)診斷提供診斷試劑，而且還可用于進一步研究柑橘潰瘍病菌與寄主的初步識別機制，為柑橘潰瘍病菌的生物防治提供理論依據(jù)。其主要研究結(jié)果如下： ①利用柑橘潰瘍

6、病菌細胞懸浮液免疫BALB/c小鼠，免疫后小鼠抗血清效價為2500倍左右，符合建庫要求。 ②提取小鼠脾細胞mRNA，構(gòu)建的單鏈抗體文庫重鏈大小為350bp左右，輕鏈為650bp左右，經(jīng)linker(Gl<,y3>Ser)<,4>連接后單鏈抗體大小為1.2kb左右。將單鏈抗體文庫DNA克隆到大腸桿菌JM109中，隨機挑選了9個克隆子測序表明，9條單鏈抗體序列都是開放閱讀框，其重鏈分別屬于VH1、VH2、VH3基因家簇，輕鏈屬于VK

7、Ⅰ、VKⅢ、VKⅣ亞基因家簇。每個單鏈抗體的互補決定區(qū)(CDRs)都為不同的 CDR，其中氨基酸序列變化多樣，說明構(gòu)建的單鏈抗體文庫多樣性好，適合于進一步進行單鏈抗體的篩選。 ③將構(gòu)建的單鏈抗體文庫進行體外轉(zhuǎn)錄和體外翻譯后，產(chǎn)生了單鏈抗體-核糖體-mRNA(ARM)三聯(lián)復(fù)合體文庫。用柑橘潰瘍病菌O特異性脂多糖親和篩選翻譯產(chǎn)生的ARM三聯(lián)復(fù)合體，洗滌后，將保留的ARM復(fù)合體解離，釋放mRNA，并對mRNA進行了反轉(zhuǎn)錄PCR擴增得到

8、篩選后的單鏈抗體DNA文庫，然后重復(fù)體外轉(zhuǎn)錄-體外翻譯-親和篩選-RT-PCR擴增過程，得到反復(fù)篩選幾輪的單鏈抗體DNA文庫。結(jié)果顯示第一輪核糖體展示后回收的mRNA量非常少，分光光度計已測不出其濃度，反轉(zhuǎn)錄。RCR 后，擴增得到的條帶非常弱，說明在原始未篩選的抗體文庫中，能與柑橘潰瘍病菌 O 特異性脂多糖作用的單鏈抗體數(shù)量較少。經(jīng)過三輪篩選后，得到的mRNA量逐漸增多，經(jīng)RT-PCR后，產(chǎn)生了比較亮的擴增條帶。說明在核糖體展示過程中，

9、抗原陽性的單鏈抗體得到了富集。 ④將未經(jīng)過篩選的原始單鏈抗體文庫 DNA 和經(jīng)過三輪篩選的單鏈抗體文庫DNA與噬菌體表達載體pCANTAB5E相連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1 中小量表達。表達后用間接ELISA 測定單鏈抗體與抗原的結(jié)合活性。結(jié)果表明從未經(jīng)過篩選的原始單鏈抗體文庫中隨機挑取的60個克隆子表達產(chǎn)物與柑橘潰瘍病菌 O 特異性脂多糖幾乎沒有結(jié)合能力；而從經(jīng)過三輪篩選后的單鏈抗體文庫中挑取的60個克隆子中有30％與單鏈抗體有

10、較好的結(jié)合能力。從三輪篩選后的單鏈抗體文庫中共挑取了180個克隆子，用間接ELISA 法初篩到60株抗原陽性的單鏈抗體；然后用生物傳感技術(shù)(biosensor，biacore)對篩選的抗原陽性的單鏈抗體進行了復(fù)篩，篩選了3株高親和力的單鏈抗體(Gx13、GX44和GX95)以用于下一步的表達鑒定。 ⑤將篩選的高親和力抗原陽性的克隆子從大腸桿菌 TG1 中轉(zhuǎn)入高表達菌株HB2151中進行可溶性表達。并優(yōu)化了表達條件。優(yōu)化的表達條件

11、如下： 將單鏈抗體單克隆子接種于5 ml 2×YTAG中，30℃250 r/min培養(yǎng)過夜；次日將1ml過夜培養(yǎng)液加入50 ml 2×YTAG(2×YT培養(yǎng)基中含2％葡萄糖，100μg/ml氨芐青霉素)中，30℃250 r/min培養(yǎng)至OD<,600>為0.6-0.8；3500 r/min離心20 min，棄去上清；50 ml 2×YTAI(2×YT培養(yǎng)基中含1 mM IPTG，100 μg/ml 氨芐青霉素)重懸沉淀，30℃2

12、50 r/min培養(yǎng)7 h；3500 r/min離心20 min，沉淀用0.5 ml冰冷的1×TES(0.2 MTris-HCl [pH 8.0]，0.5 mM EDTA，0.5 M sucrose)重懸，再加入0.75 ml冰冷的1/4×TES，Vortex重懸，冰上孵育30 min，高速離,10 min，留取上清，-20℃保存，此上清中含有分泌至細胞周質(zhì)中的(perplasmic extract)抗體。 ⑥單鏈抗體表達后，其

13、表達產(chǎn)物主要集中于細胞周質(zhì)提取物中，具有抗體活性。將濃縮的周質(zhì)提取物進行 SDS-PAGE 電泳，顯示在32 kDa處有一蛋白條帶產(chǎn)生。將表達產(chǎn)物純化后進行 SDS-PAGE 顯示，在32 kDa同樣有一蛋白條帶產(chǎn)生。為了進一步驗證表達的蛋白即目的蛋白，將表達產(chǎn)物進行了Western blot雜交，結(jié)果顯示，與純化后的電泳結(jié)果一致，在32 kDa處有單一的條帶產(chǎn)生，說明表達純化的蛋白即目的蛋白。 ⑦將篩選的抗原陽性單鏈抗體進行了

14、特性研究。單鏈抗體(GX95、GX44、 GX13)特異性強、親和力高。其與柑橘潰瘍病菌近源種 Xanthomonas．oryzae pv． oryzae (Xooc)；Xanthomonas．campestris pv．campestri(Xcc)；Xanthomonas．oryzae pv． oryzicola (Xoc)；及從柑橘葉片上分離的 10 種腐生黃單孢菌及 Bacillus subtilis；E. coli 都沒有交叉反

15、應(yīng)。Biacore 分析其親和力表明，單鏈抗體GX95、GX44和 GX13的親和常數(shù)分別為1.98x10<'10>M<'-1>、1.89×10<'10>M<'-1>、3.43x10<'10>M<'-1>。 ⑧對篩選的單鏈抗體進行了測序。用DNAplot軟件分析單鏈抗體序列，結(jié)果表明：單鏈抗體GX44和GX13重鏈分別屬于VH1基因家簇，GX95 重鏈屬于VH3基因家簇；GX44和GX13輕鏈屬于Vk Ⅳ亞基因家簇，GX95輕鏈