柑桔潰瘍病菌xanthomonasaxonopodispv.citri對(duì)拌種靈抗性機(jī)制的研究

1、摘 要柑桔潰 瘍病菌 ( X an t h 口 m o na sa x o n o Po d i s P v. c i t r i ) 對(duì)拌種靈抗性機(jī)制的研究摘 要拌種靈是一種高效、 廣譜的內(nèi) 吸性殺菌劑， 作為竣基酞胺類殺菌 劑中的 一個(gè)代表品種， 它不僅可以防治由 擔(dān)子菌真菌引起的植物病害， 還對(duì)植物細(xì)菌 性病害尤其是黃單胞菌具有較好的 防治效 果。本文以 拌種靈 ( a m i c a r t h i a z o 1 ) 及野生敏

2、感型柑桔潰瘍病 菌 ( X an t h 口 m o n a sa x o n o po d i s p 磯 c i t r 。為 材 料， 系 統(tǒng) 研究 了 通 過 紫 外 誘導(dǎo) 的 柑 桔 潰瘍病菌 抗藥突 變體的 生理生化及分子生物學(xué)特性， 揭示了 柑桔潰瘍病菌對(duì)拌種靈產(chǎn)生抗性的原因， 并從分子遺傳學(xué)的角度加以 驗(yàn)證。以 野生敏感型柑桔潰瘍病菌X c為親本， 通過紫外誘導(dǎo)獲得了3 個(gè)室內(nèi) 抗拌種靈突變體: x u v1 0 ， x

3、 u v 2 0 ， x u v 4 o 。 拌種靈對(duì)相桔潰瘍病菌敏感菌株x c的最低抑制濃度( m i n i m a l i n h i b i t i o n o n c e n t r a t i o n ， M I C ) 為 1 0 0 群 9 / mL ， 而 對(duì) 3個(gè) 抗 藥 突 變 體均 為4 0 伽留 m L : 有效中 濃度( m e d i u me f ec t i v e c o n c e n t r a

4、t i o n ， E c o 0 ) 分別為1 4 6 3 8 ， 3 3 . 3 4 7 3 ，2 4 ， 6 2 7 8和加4 6 8 1群 9 八 1 飛 L 。 紫外誘導(dǎo)并沒 有影響 抗藥突變體的菌體生長 速率和致病力。對(duì)抗藥 突變體的 致病力測定 顯示， 活體條 件下抗藥突變體的致病力與X c相比 并未下降，即 使在低至 l o Z c f u / r nL 濃度的菌液仍能在柑桔葉片 上產(chǎn)生典型的潰 瘍癥 狀。采 用P c

5、R 方 法 擴(kuò) 增 并 克 隆了 xa x on o p o d i s p M 。 i t r i野 生 敏 感 型 菌 株x c 及 其抗 藥突 變體 的 致 病基 因 p 翻 及 與 之功 能 密切 相關(guān) 的h 心 刀 7 、 人 ， 刀 2 基 因。 p t h a 、 h l 夕 F 和h 矛 夕 B Z基 因 全 長 分 別為3 4 9 2 b p 、 2 4 7 5 b p 和3 9 3 b p ， G + c % 含 量

6、 分 別 為6 6 8 7 % 、 5 5 4 2 % 和6 0 習(xí) 5%， 其編碼的 蛋白 分別具 有 1 0 6 3 、 8 2 4 和1 3 0 個(gè) 氨基酸， 大小分別為1 2 2 3 3 5 0 4 、 8 5 . 4 6 0 9和1 3. 7 9 9 kD a ， 等電點(diǎn)分別為8 . 2 1、 左 5 2 和8 ， 2 9 。 序列對(duì)比分析發(fā) 現(xiàn)， 在致病基因p t h A中 ， 存 在 著1 4 . 5 個(gè)l o Z b p

7、 的 銜 接 重 復(fù) 序 列 ( l o Z b p t a n d e m r e p e a t s ) ， 3 個(gè) 核定 位 信號(hào)( n u c l e a r I 0 c a l i z a l j o n s i g n a l s ) · 但 是 在x c c 及 其 抗 藥 突 變 體 的 尸 尤 聲 理 月 、 兒 J 夕 廠 、 人 了 夕 召 2 基 因中，均未發(fā)現(xiàn)基因突變，抗藥性的產(chǎn)生與它們無直接關(guān)系。采

8、用 氯 化三 苯 基 四 畔 氮 ( t r i p h e n y l t o t r a z o l i u m 比 l o r i d e ， 1 ， r 〔 ) 法 測 定 了 拌 種 靈 對(duì) 柑桔潰瘍病 菌野生型及抗藥菌株 唬拍酸 脫氫酶活性的抑制作用。 結(jié) 果發(fā)現(xiàn)， 抗藥突變體的 玻拍酸 脫氫酶活性顯 著的 低于野生 型菌株。在不加拌種靈處理的情況下，X c及其摘 要采用高效電 轉(zhuǎn)化的方法， 將重組粘粒轉(zhuǎn)入不同 的宿主菌中。

9、結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 含有紫外抗藥突 變 體X U V 4。 的s d hB 基因 的 重 組 粘 粒p u 班x 4 0在 轉(zhuǎn) 化 到 柑 桔 潰 瘍 病 菌的 野 生 敏 感型菌株 X 鄺 后能使其對(duì)拌種靈產(chǎn)生抗性。 這就 證實(shí)了 發(fā)生在 柑桔潰瘍病菌 S Q R的S dh B亞基中的 H j s 一L eu突變是導(dǎo) 致柑桔潰瘍病菌對(duì)拌種靈 產(chǎn)生抗藥性的原因， 而S d h B亞 基中的5 一 3 中 心可能 正是拌種靈與唬泊酸脫氫酶的結(jié)合