柑桔潰瘍病的定量PCR檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究.pdf

1、柑桔潰瘍病(CitrusBacterialCankerDisease，CBCD)是嚴(yán)重危害世界柑桔種植業(yè)的一種細(xì)菌性病害，其病原物為地毯草黃單胞桿菌柑桔致病變種Xanthomonosaxonopodispv.citri(Xac)。CBCD廣泛發(fā)生在世界各主要柑桔產(chǎn)區(qū)，包括亞洲、中東、非洲、太平洋和印度洋諸島、澳大利亞、南美以及美國(guó)東南部的三十多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有不同程度的發(fā)生。我國(guó)的CBCD主要分布在福建、廣東、廣西、江西、浙江、湖南、湖

2、北以及云、貴、川等南方柑桔種植區(qū)。該病能侵染絕大多數(shù)商業(yè)栽培品種，雖然很少會(huì)直接殺死寄主，但會(huì)導(dǎo)致落葉、落果、樹(shù)勢(shì)衰弱和果實(shí)生銹斑且品質(zhì)變劣，嚴(yán)重降低了果品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 長(zhǎng)期以來(lái)由于缺乏抗病品種和特效的化學(xué)防治藥劑，對(duì)該病的防治主要采取加強(qiáng)非疫區(qū)建設(shè)與植物檢疫來(lái)嚴(yán)防病害的傳播，對(duì)病樹(shù)采取挖除并集中燒毀的根除措施。柑桔非疫區(qū)建設(shè)的疫情監(jiān)測(cè)和柑桔苗木、果品出入境檢疫檢驗(yàn)要求快速準(zhǔn)確的診斷鑒定技術(shù)為支撐。 傳統(tǒng)上柑桔潰瘍病的檢

3、測(cè)方法有常規(guī)檢測(cè)法，包括典型癥狀目測(cè)法、組織病理切片法和病原菌分離培養(yǎng)及致病性測(cè)定法等。此外還有噬菌體檢測(cè)法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和斑點(diǎn)免疫結(jié)合法(DIA)。這些方法在一定程度上存在著檢測(cè)周期長(zhǎng)、操作復(fù)雜、靈敏度不高的缺點(diǎn)，不能很好的滿足檢疫工作的要求。 隨著生物技術(shù)尤其是DNA重組技術(shù)的飛速發(fā)展，與植物致病性相關(guān)基因不斷地被鑒定和克隆出來(lái)，許多重大疫病的診斷治療己逐步進(jìn)入分子水平。分子水平的檢測(cè)具有快速、特異、靈敏的特

4、點(diǎn)，可以滿足現(xiàn)代植物檢疫工作的要求。作為國(guó)內(nèi)外重要的檢疫性有害生物，近年來(lái)柑桔潰瘍病菌的快速檢測(cè)技術(shù)研究也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。DNA雜交診斷法、DNA指紋圖譜分析等方法特別是PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，使CBCD的檢驗(yàn)檢疫工作有了一種更加快速、準(zhǔn)確、靈敏、便捷的快速檢測(cè)方法。而熒光定量PCR(Realtime-PCR或FQ-PCR)作為更新的技術(shù)，與常規(guī)PCR相比，具有更高的檢測(cè)靈敏度和特異性，不僅能更快速更準(zhǔn)確的對(duì)病原物進(jìn)行檢測(cè)鑒定，無(wú)需凝膠

5、電泳分析，避免EB等致癌危險(xiǎn)試劑的使用，更環(huán)保安全，而且還能對(duì)帶菌量進(jìn)行定量分析。該項(xiàng)技術(shù)不僅可以在柑桔苗木與產(chǎn)品的口岸檢驗(yàn)檢疫及國(guó)際貿(mào)易爭(zhēng)端中發(fā)揮重要作用，而且還可以用于柑桔潰瘍病菌侵染過(guò)程中的流行學(xué)研究以及病害的預(yù)警監(jiān)測(cè)。 本研究的目的：在柑桔潰瘍病常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，建立起全新的具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的定量PCR檢測(cè)技術(shù)方法，為柑桔潰瘍病的快速準(zhǔn)確鑒定以及病害監(jiān)測(cè)預(yù)報(bào)提供技術(shù)支持。 本研究的主要方法：根據(jù)柑桔

6、潰瘍病菌的全基因組序列，選擇位于Xac染色體上的獨(dú)有保守蛋白基因，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)篩選出分別用于SYBRGreenI染料和TaqMan探針RTi-PCR檢測(cè)的特異性引物對(duì)及探針；進(jìn)行保守蛋白基因擴(kuò)增片段克隆，以重組質(zhì)粒構(gòu)建無(wú)害化標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照，用于定量檢測(cè)；參照商業(yè)反應(yīng)混合液，優(yōu)化Mg2+濃度、引物濃度、熱啟動(dòng)DNA聚合酶濃度、dNTP濃度、TaqMan探針及SYBRGreenI染料濃度等反應(yīng)成分，優(yōu)化PCR擴(kuò)增程序，開(kāi)發(fā)出低成本的自

7、配定量PCR反應(yīng)試劑；以柑桔葉片腐生非致病菌為對(duì)照，驗(yàn)證兩種定量PCR方法的特異性，以10倍梯度稀釋的Xac菌懸液和DNA溶液測(cè)試定量PCR檢測(cè)技術(shù)的靈敏度；對(duì)四川、重慶、廣西等地田間樣品的實(shí)際檢測(cè)，并對(duì)其中的部分樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)和致病性測(cè)定以驗(yàn)證該檢測(cè)技術(shù)的可靠性和準(zhǔn)確性。 最后成功建立了兩種特異、準(zhǔn)確的柑桔潰瘍病菌RTi-PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)Xac細(xì)菌檢測(cè)靈敏度達(dá)到1～5個(gè)細(xì)菌/25μL，對(duì)Xac靶片段DNA的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1