檸檬枝枯病與柑桔腳腐病菌的PCR檢測技術研究.pdf

1、由桔莖點霉(Phomatracheiphila)引起的檸檬枝枯病(Malsecco)是一種檢疫性真菌病害，主要分布在地中海、黑海地區(qū)，對許多沿海周邊國家的柑桔生產(chǎn)尤其是檸檬生產(chǎn)造成了一定的經(jīng)濟損失。我國尚未發(fā)現(xiàn)檸檬枝枯病，但隨著國際貿(mào)易日益加大，其傳播和擴散的風險性增大，因此許多國家及地區(qū)的植物保護組織已將該病列為檢疫對象。建立準確、快速的檢測技術體系用于口岸檢疫，對于預防檸檬枝枯病的傳入至關重要。 柑桔腳腐病(Footroto

2、fcitrus)是由疫霉菌(Phytophthoraspp.)引起的一種真菌性病害，在世界范圍內廣泛分布。該病是一種土傳病害，主要危害甜橙類柑桔樹近地表根頸部，引起腐爛，導致樹勢下降。建立準確、快速的柑桔腳腐病菌檢測體系，為病害的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供依據(jù)和指南，對柑桔腳腐病的防治與確保柑桔產(chǎn)業(yè)健康、穩(wěn)步發(fā)展的意義重大。并可對該類難分離菌的種間序列比對研究提供手段，從而為其分子分類研究奠定基礎。 傳統(tǒng)的植物病原真菌診斷方法如癥狀觀察

3、與病原菌的分離鑒定、血清學鑒定、DNA分子雜交，存在檢測靈敏度不高、潛癥帶菌難以檢出、耗費時間等缺點。加之柑桔腳腐病存在混合侵染，即便使用選擇性培養(yǎng)基，要從病組織或土壤中分離到每種病原物的純培養(yǎng)做形態(tài)學觀察也比較困難。 本實驗旨在建立穩(wěn)定、靈敏、快速的檸檬枝枯病和柑桔腳腐病的PCR檢測技術體系，主要實驗結果如下： 1.在國內首次建立了兩個檸檬枝枯病的PCR檢測體系，自主設計的引物對Pta-1/Pta-2和Ptb-1/Pt

4、b-2分別擴增得到了325bp和468bp的目的條帶。 2.引物Pta-1/Pta-2和Ptb-1/Ptb-2可以穩(wěn)定檢出致病菌桔莖點霉(P.tracheiphila)，而不能檢出柑桔炭疽病、柑桔黃龍病、柑桔潰瘍病、柑桔雜色褪綠病的病原及健康柑桔組織的DNA。 3.引物Pta-1/Pta-2對P.tracheiphila總核酸的檢出極限濃度為10pg/μL。 4.在國內首次應用PCR檢測技術對柑桔腳腐病致病菌——

5、疫霉菌進行快速檢測，擴增得到了700bp的特征性條帶。 5.從中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所果園內患腳腐病的柑桔樹上分離獲得了疫霉菌，應用巢式PCR檢測技術將其鑒定為寄生疫霉，擴增得到了120bp的特征性條帶。 6.采用巢式PCR技術對木質化腳腐病組織中的病原菌進行檢測，先后擴增得到了700bp和120bp的特征性條帶，檢測出寄生疫霉。 7.對寄生疫霉和煙草黑脛病菌在rDNA的18S-ITS1-5.8S-ITS2-28