柑桔轉(zhuǎn)基因成分精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國際服務(wù)組織(ISAAA)的統(tǒng)計(jì)資料顯示,截至2011年,種植轉(zhuǎn)基因作物的國家和地區(qū)的數(shù)量增加至29個(gè),全球轉(zhuǎn)基因作物年種植面積達(dá)到1.6億hm2,比1996年增長了94倍。目前,國內(nèi)外上市的轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品也愈來愈多如:轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因油菜和轉(zhuǎn)基因番茄等,由此引發(fā)的安全性問題也引起了人們的廣泛關(guān)注,如何準(zhǔn)確檢測(cè)和識(shí)別轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品,也成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 柑桔是世界第一大水果,

2、橙汁是世界第一大果汁飲料。近年來,植物基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)為柑桔品種遺傳改良開辟了一條新途徑,多個(gè)柑桔轉(zhuǎn)基因品種已經(jīng)進(jìn)入中間試驗(yàn)階段?？梢灶A(yù)見,在不久的將來,轉(zhuǎn)基因柑桔的商品化將成為必然。因此,開展柑桔產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)研究、建立轉(zhuǎn)基因柑桔產(chǎn)品精準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)體系已顯得十分必要和迫切。
　　 本研究以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國家柑桔品種改良中心獲得的轉(zhuǎn)基因柑桔為材料,建立了柑桔轉(zhuǎn)基因成分的定性和定量檢測(cè)體系。主要結(jié)果如

3、下:
　　 1.柑桔轉(zhuǎn)基因成分多重PCR定性檢測(cè)體系的建立
　　 以轉(zhuǎn)基因錦橙為材料,根據(jù)GenBank中pBI121質(zhì)粒序列和柑桔(Citrus.)Actin基因序列,分別設(shè)計(jì)出CaMV35S啟動(dòng)子、NOS啟動(dòng)子、NOS終止子特異引物和Actin基因的特異引物。通過正交試驗(yàn)確定最佳的引物濃度和比例,PCR反應(yīng)體系中各因素的濃度及反應(yīng)程序,建立了能同時(shí)檢測(cè)出四種序列的多重PCR檢測(cè)體系。該檢測(cè)體系靈敏度達(dá)到了0.1%,理

4、論上已經(jīng)能滿足柑桔及其加工產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)。
　　 2.轉(zhuǎn)基因柑桔定量檢測(cè)體系的建立
　　 采用Taqman探針熒光定量PCR技術(shù),建立轉(zhuǎn)基因柑桔中35S啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)方法。首先,以Actin為內(nèi)源參照參基因,35S啟動(dòng)子為目標(biāo)基因,設(shè)計(jì)特異性引物和探針。用FAM熒光染料基團(tuán)和Cy5熒光染料基團(tuán)分別標(biāo)記Actin基因和35S啟動(dòng)子的特異性探針,然后,建立轉(zhuǎn)基因柑桔多重Taqman熒光定量檢測(cè)體系,該體系可