基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增轉(zhuǎn)基因成分可視化檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，已被廣泛用于各領(lǐng)域。同時(shí)，LAMP的高靈敏度也使擴(kuò)增產(chǎn)物開(kāi)蓋檢測(cè)極易出現(xiàn)污染，而利用閉管檢測(cè)技術(shù)能有效降低污染機(jī)率。目前， LAMP結(jié)果檢測(cè)方法主要有電泳、濁度分析、熒光染料、LFD、微流控等，其中應(yīng)用較多的是電泳、濁度分析、HNB以及SYBR Green I指示劑。現(xiàn)有方法存在需開(kāi)蓋

2、、材料昂貴、顏色變化均屬同一色系等不足，為此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三項(xiàng)獨(dú)立的研究，主要研究成果如下：
　　(1) LAMP-ACBK檢測(cè)系統(tǒng)：本實(shí)驗(yàn)引入一種新型的金屬指示劑-酸性絡(luò)藍(lán) K（Acid Chrome Blue K，ACBK）建立了閉管LAMP結(jié)果可視化檢測(cè)技術(shù)。首先，我們?cè)贚AMP擴(kuò)增的起始體系中，分別測(cè)試了ACBK與緩沖液、dNTPs、引物、Mg2+等組分的反應(yīng)，確定了含ACBK的LAMP體系其顏色變化由Mg2+決定，化學(xué)方法

3、也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論。隨后以花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子（CAMV35S，35S）為靶基因，建立了35S LAMP-ACBK檢測(cè)體系。該體系的檢測(cè)靈敏度針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)限為100拷貝，在分別含有50 ng的水稻、大豆、油菜和玉米基因組中能檢測(cè)出0.1％的轉(zhuǎn)基因含量。同時(shí)，利用不同轉(zhuǎn)化事件及不同轉(zhuǎn)基因作物為材料驗(yàn)證了其檢測(cè)特異性，結(jié)果表明構(gòu)建的35S LAMP-ACBK檢測(cè)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的檢測(cè)特異性。最終，將該檢測(cè)體系成功用于對(duì)實(shí)際玉米

4、樣品轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果既可以裸眼直接判斷也可以借助紫外可見(jiàn)光譜分析。
　　(2) LAMP-G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)：以G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶實(shí)驗(yàn)所產(chǎn)生的綠色為基礎(chǔ)建立了 LAMP擴(kuò)增和結(jié)果可視化檢測(cè)技術(shù)。首先，在 LAMP擴(kuò)增體系中分別加入（FIP/BIP，F(xiàn)LP/BLP），（FIP/BIP-G4，F(xiàn)LP/BLP），（FIP/BIP，F(xiàn)LP/BLP-G4），（FIP/BIP-G4， FLP/BLP-G4）四組引物組合，

5、在63°C（12，24，36，48，60）min，85°C2 min擴(kuò)增條件下擴(kuò)增，確定了（FIP/BIP，F(xiàn)LP/BLP-G4）為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增引物。隨后以含35S的轉(zhuǎn)基因材料模板，建立了35S LAMP-G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)，且該系統(tǒng)針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的檢測(cè)限為32 ng/μL。同時(shí)，利用不同轉(zhuǎn)化事件及不同作物的轉(zhuǎn)基因材料驗(yàn)證了其檢測(cè)特異性，結(jié)果表明構(gòu)建的35S LAMP-G-四聯(lián)體過(guò)氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)具有很強(qiáng)的檢測(cè)特異性。

6、　　(3) LAMP-試紙條檢測(cè)系統(tǒng)：本研究旨在建立一種基于試紙條的35S或TNOS的LAMP擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)方法，該方法在LAMP擴(kuò)增結(jié)束后2-3 min內(nèi)即可用肉眼判讀結(jié)果。首先對(duì)修飾后的LAMP引物做了可用性檢測(cè)，隨后，對(duì)試紙條的特異性及靈敏度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，評(píng)價(jià)所用的5種陽(yáng)性樣品均出現(xiàn)質(zhì)控線與檢測(cè)線，電泳呈特異的梯狀條帶，與普通PCR結(jié)果一致。表明該試紙條可用于35S及TNOS LAMP擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)，且有較高的特異性，兩種試