環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)轉(zhuǎn)crylA基因抗蟲水稻、棉花的研究.pdf

1、自上世紀(jì)80年代以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)經(jīng)歷了迅猛的發(fā)展，給人們帶來了很大的便利，現(xiàn)在已有許多的轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入了我們的日常生活。轉(zhuǎn)基因作物具有產(chǎn)量高、抗逆性好、品質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)，但關(guān)于轉(zhuǎn)基因食品的安全性、生態(tài)安全等問題也一直備受關(guān)注。許多國(guó)家已經(jīng)出臺(tái)了相應(yīng)的法律法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其衍生產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理，因此這就迫切需要合適的檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行監(jiān)控。
　　 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal ampl

2、ification，LAMP)是日本榮研株式會(huì)發(fā)明的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，與PCR技術(shù)相比具有操作簡(jiǎn)單、快速、特異性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。它是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒溫條件65℃左右下進(jìn)行擴(kuò)增，可在1h內(nèi)將靶基因片段擴(kuò)增109～1010倍，因而具有很高的靈敏度和特異性。
　　 本論文建立了用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)轉(zhuǎn)cry1A基因抗蟲水稻和抗蟲棉花的方法。本

3、研究根據(jù)郭三堆專利中轉(zhuǎn)基因植物(專利申請(qǐng)?zhí)?5119563.8，公開號(hào)為CN1134981A)所應(yīng)用的人工合成的殺蟲蛋白質(zhì)融合基因（cry1A基因）序列，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并對(duì)鎂離子濃度、dNTPs濃度、反應(yīng)溫度、內(nèi)外引物比、Bst DNA聚合酶濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立LAMP檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因棉花的最佳反應(yīng)體系。
　　 LAMP檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻25μL反應(yīng)體系如下:LAMP反應(yīng)上、下游外引物F3、B3濃度

4、均為0.5 mmol/L;上、下游內(nèi)引物FIP、BIP濃度均為3.0 mmol/L;其他反應(yīng)組分終濃度分別為:2.5μL Bst DNA聚合酶緩沖液(20 mM Tris-HC1(pH8.8，25℃)，10mM KCl,10 mM(NH4)2SO4,2 mM MgSO4,0.1％ Triton X-100），Mg2+濃度0.5mmol/L，dNTPs濃度為6.0 mmol/L，8 UBst DNA聚合酶大片段的添加量為0.7μL，模板D

5、NA濃度為50 ng/μL;反應(yīng)條件為65℃恒溫反應(yīng)60 min，80℃2 min使酶滅活。檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的LAMP25μL反應(yīng)體系為:Mg2+濃度為1.0 mmol/L，dNTPs濃度為5.0 mmol/L，其它與檢測(cè)水稻的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件一致。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，產(chǎn)生預(yù)期的梯形條帶。
　　 采用CTAB法制備DNA模板進(jìn)行PCR和LAMP反應(yīng)，其方法的檢出限分別為0.1％和0

6、.01％，LAMP方法的檢出限是PCR的10倍。另外，對(duì)3種非轉(zhuǎn)基因水稻、3種棉花、2種非轉(zhuǎn)基因大豆、2種非轉(zhuǎn)基因番茄及3種含cry1Ac基因的陽性Bt菌株分別進(jìn)行了PCR反應(yīng)和LAMP反應(yīng)來驗(yàn)證引物的特異性，PCR和LAMP反應(yīng)結(jié)果是一致的，轉(zhuǎn)基因棉花魯棉17為陽性，其他兩種非轉(zhuǎn)基因棉花也為陽性，可能是在田間以被污染，其他樣品均為陰性結(jié)果，說明建立的LAMP方法具有很好的特異性。
　　 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)可在60 min內(nèi)完成，

7、對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因棉花檢測(cè)的整個(gè)過程(包括DNA提取60 min、LAMP反應(yīng)60min和電泳30 min)可在2.5 h內(nèi)完成，比傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方法時(shí)間縮短一倍，且儀器要求簡(jiǎn)單。如在LAMP反應(yīng)結(jié)束后在反應(yīng)管中加入SYBR GreenⅠ熒光染料，通過混合液的顏色可直接判斷擴(kuò)增是否發(fā)生，整個(gè)檢測(cè)可在2h內(nèi)完成，建立了轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因棉花的LAMP檢測(cè)方法。
　　 總之，本研究建立的LAMP檢測(cè)抗蟲轉(zhuǎn)cry1A水稻、棉花技術(shù)，