豬弓形蟲(chóng)病環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的建立與評(píng)價(jià).pdf

1、弓形蟲(chóng)病(Toxoplasmosis)是一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，其常用的診斷方法包括病原學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法。但這些方法在特異性、簡(jiǎn)便程度、溫度和試劑儀器要求等方面各有缺點(diǎn)。因此，建立一種既敏感、特異，又簡(jiǎn)便實(shí)用的弓形蟲(chóng)病診斷方法是迫切需要的。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)通過(guò)具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶完成靶序列的擴(kuò)增，僅需恒溫加熱就能

2、擴(kuò)增DNA，可以通過(guò)觀察利用核酸染料染色觀察而直接判定結(jié)果，具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。 本研究利用多拷貝的弓形蟲(chóng)AF146527基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)引物并建立了LAMP檢測(cè)方法，以1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的方法對(duì)反應(yīng)體系(包括鎂離子、甜菜堿濃度)及反應(yīng)條件(包括反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間)進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)1.5％瓊脂糖凝膠染色及PicoGreen染色確定LAMP檢測(cè)敏感性并與常規(guī)PCR檢測(cè)方法進(jìn)行敏感性比較。結(jié)果表明，當(dāng)采用6 mmo

3、I/LMg<'2+>、0.8mmol/L的甜菜堿的反應(yīng)體系，63℃反應(yīng)60min即可完成檢測(cè)，所建立的弓形蟲(chóng)LAMP檢測(cè)方法敏感性達(dá)到6.4pg質(zhì)粒。采用LAMP的一對(duì)外引物作為常規(guī)PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)弓形蟲(chóng)的敏感性只有128pg，即采用LAMP方法檢測(cè)弓形蟲(chóng)的敏感性是常規(guī)PCR檢測(cè)的20倍，直接采用PicoGreen染色觀察也得到相同的結(jié)果，而且同球蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)及豬組織DNA沒(méi)有交叉反應(yīng)。即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(LAMP)是