隱孢子蟲和弓形蟲重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、隱孢子蟲(Cryptosporidium spp.)和弓形蟲（Toxoplasma gondii）是兩種不同種屬的寄生性原蟲。它們能夠感染幾乎所有的溫血動物，并廣泛分布于世界各地，對人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。奶牛感染隱孢子蟲后，其大量的卵囊由奶牛的糞便散布到環(huán)境中。隨著奶牛畜牧業(yè)的發(fā)展，奶牛糞便成為隱孢子蟲的重要傳染源。貓科動物感染弓形蟲后，大量的弓形蟲卵囊可隨貓的糞便散播到環(huán)境中，孢子化的卵囊具有極強(qiáng)的感染能力，并且對外界環(huán)

2、境有較強(qiáng)的抵抗力。因此建立高效、快速檢測奶牛糞便中隱孢子蟲卵囊和環(huán)境中弓形蟲卵囊的方法，對控制隱孢子蟲病和弓形蟲病的傳播顯得尤為重要。
　　重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是近幾年出現(xiàn)的有望替代PCR的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)。反應(yīng)過程中不需要模板鏈的熱變性，可以在恒定的低溫條件下快速擴(kuò)增DNA或者RNA。其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、操作簡便、適用于現(xiàn)場快速診斷等

3、特點(diǎn)，在動物病原的快速檢測方面具有巨大的前景和市場。結(jié)合相應(yīng)的探針，RPA擴(kuò)展產(chǎn)物可以在側(cè)流層析試紙條（lateral flow strip）上顯色，從而形成的側(cè)流層析-重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(LF-RPA)比PCR更加適合于現(xiàn)場檢測。本研究應(yīng)用LF-RPA技術(shù)，建立了快速檢測奶牛糞便中隱孢子蟲和環(huán)境中弓形蟲的方法。研究結(jié)果如下:
　　1.隱孢子蟲卵囊的DNA可在月桂酰肌氨酸鈉(LSS)濃度為0.1％的熱水中釋放。釋放的隱孢子蟲DN

4、A用LF-RPA方法進(jìn)行檢測，在30-45℃的條件下，30分鐘內(nèi)最低可檢測到0.5個(gè)隱孢子蟲卵囊的DNA，敏感性高于傳統(tǒng)的PCR檢測方法，并且與弓形蟲、藍(lán)氏賈第蟲、柱狀艾美爾球蟲和微孢子蟲無交叉反應(yīng)。對12份奶牛糞便進(jìn)行檢測，巢式PCR檢測出4份為隱孢子蟲陽性，而LF-RPA檢測出6份為隱孢子蟲陽性。
　　2.由于弓形蟲卵囊壁結(jié)構(gòu)的堅(jiān)固性，本研究將環(huán)境樣品用液氮冷凍并進(jìn)行反復(fù)研磨以得到弓形蟲卵囊的DNA。基于弓形蟲B1基因設(shè)計(jì)的引