基于重組酶聚合酶擴增技術的柯薩奇A6型病毒的快速檢測方法的建立.pdf

1、目的:
　　手足口病(HFMD，hand foot mouth disease)是全世界，尤其是在亞太地區(qū)流行的病毒性傳染病，主要感染5歲以下兒童，嚴重威脅兒童健康和生命。HFMD由多種病毒導致，主要包括腸道病毒71(EV71enterovirus71)型、柯薩奇病毒(CA，coxsakievirus)A16、A4、A6、A10、B3、B5以及艾克病毒30型等。近年來，多項研究表明HFMD的致病病原體譜發(fā)生改變，CA6成為越來越重

2、要的病原體，在全世界范圍內(nèi)已導致多起HFMD暴發(fā)。CA6可以引起重癥HFMD病例，并可導致部分重癥患兒死亡。CA6常引起非典型的HFMD，容易導致誤診。HFMD尚無有效治療藥物，針對EV71的CA16的單價以及雙價疫苗已進入臨床試驗階段。但針對多種病毒的多價疫苗進展緩慢。HFMD主要預防和控制措施是切斷傳播，對癥治療以減少并發(fā)癥的出現(xiàn)。加強HFMD的全球流行病學和實驗室病原學監(jiān)測，預測新的暴發(fā)疫情將有助于HFMD的預防和控制，而病原體的

3、快速檢測則是HFMD有效監(jiān)測和診斷的關鍵。
　　重組酶聚合酶擴增技術(RPA，recombinase polymerase amplification)是英國Twist DX公司商業(yè)化的新型核酸擴增檢測技術，該技術不依賴于昂貴的儀器，在37-42度的恒溫條件下可完成對目的基因的擴增和檢測，有多種探針可應用于產(chǎn)物檢測，大大提高了檢測的特異性。另外，其擴增產(chǎn)物也可以進行測序分析，增加了其可核對性。RPA技術可以在20min內(nèi)實現(xiàn)對病原

4、體的檢測，是目前最快速的核酸擴增檢測方法，已被廣泛用于病原體的快速檢測。所以，RPA技術非常適合于傳染病暴發(fā)現(xiàn)場的快速檢測。本研究旨在建立針對CA6的實時熒光逆轉(zhuǎn)錄一步法重組酶聚合酶(RT-RPA，reverse transcription remconbinase polymerase amplification)快速檢測方法。
　　方法:
　　在Genbank下載CA6病毒的VP1蛋白的基因序列，并比對序列尋找保守區(qū)。針

5、對保守區(qū)設計特異性的引物，進行引物篩選并設計相應的探針，隨后建立針對CA6的實時熒光RT-RPA快速檢測方法。將含有目的片段的cDNA連接至載體，并進行體外轉(zhuǎn)錄，計算核酸濃度并轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)/μl，隨后進行10倍梯度稀釋，每個梯度設置8個重復，分別用實時熒光RT-RPA檢測和商業(yè)化CA6熒光定量PCR檢測試劑盒檢測，概率元分析計算其95％檢測限。用RT-RPA檢測對照病毒，分析其特異度。分別利用RT-RPA和商業(yè)化CA6熒光定量PCR檢測

6、試劑盒檢測234份EV71和CA16陰性的HFMD病例的糞便樣本，分析檢測結(jié)果一致性，計算Kappa值。
　　結(jié)果:
　　RT-RPA檢測方法的反應時間為20min。RT-RPA檢測方法只與CA6發(fā)生反應，產(chǎn)生擴增曲線，沒有與任何對照病毒發(fā)生反應，其特異度為100％。RT-RPA的95％檢測限低至231拷貝/反應，與商業(yè)化熒光定量PCR無差別。臨床樣本的檢測結(jié)果顯示RT-RPA檢測方法與商業(yè)化CA6熒光定量PCR檢測試劑盒的