五種重要動物病毒快速恒溫擴增檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用.pdf

1、傳染病是引起全世界畜牧業(yè)經(jīng)濟損失的最重要原因之一。羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)和羊痘病毒(Capripoxvirus，CaPV)是引起羊皮膚、粘膜皰疹和潰瘍的重要病毒；而豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(Porcine circovims.type2，PCV2)、偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)及細小病毒(Porcine parvovirus virus，PPV)則是引起豬繁殖障礙的重要病毒?？焖?、

2、簡單及特異性診斷在疫病防控中至關(guān)重要。重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一種簡單、快速、敏感性高及特異性強的新型恒溫擴增技術(shù)，能在37-42℃恒溫條件下，20 min內(nèi)完成檢測。本研究首次分別建立了快速檢測上述五種病毒的熒光探針和側(cè)流式免疫層析RPA檢測方法，并成功地應(yīng)用于田間樣品檢測。具體研究結(jié)果如下:
　　1.分別建立了快速檢測 ORFV(ORFV real-

3、time RPA)、CaPV（CaPV real-time RPA）、PCV2(PCV2 real-time RPA)、PRV(PRV real-time RPA)及PPV（PPV real-time RPA）的熒光探針RPA方法，其靈敏度分別為100拷貝/反應(yīng)、300拷貝/反應(yīng)、100拷貝/反應(yīng)、100拷貝/反應(yīng)和300拷貝/反應(yīng)，并均能特異性的檢測相應(yīng)的病毒。利用上述建立的方法分別檢測相應(yīng)的田間樣品，并與相對應(yīng)的real-time

4、qPCR比較，檢出率分別為93％、94％、100％、93％及94％。
　　2.分別建立了快速檢測ORFV（ORFV RPA LFD）、CaPV(CaPVRPALFD)、PCV2(PCV2 RPALFD)、PRV（PRVRPA LFD）及PPV(PPV RPA LFD)的側(cè)流式免疫層析RPA方法，其靈敏度分別為80拷貝/反應(yīng)、300 DNA拷貝/反應(yīng)、100拷貝/反應(yīng)、160拷貝/反應(yīng)及400拷貝/反應(yīng)，并均能特異性的檢測相應(yīng)的病毒

5、。利用上述建立的方法分別檢測相應(yīng)的田間樣品，并與相對應(yīng)的real-time qPCR比較，檢出率分別為95％、97％、100％、93％及94％。
　　3.為了能同時檢測樣品中的ORFV和CaPV，建立了ORFV和CaPV雙重熒光探針RPA方法（duplex real-time RPA），其檢測ORFV和CaPV DNA的靈敏度分別為1000拷貝/反應(yīng)和1200拷貝/反應(yīng)。為了能同時檢測PCV2、PRV及PPV，建立了多重熒光探針R

6、PA(multiplx real-timeRPA)，其檢測PCV2、PRV及PPV靈敏度分別為10000拷貝/反應(yīng)、1000拷貝/反應(yīng)和1200拷貝/反應(yīng)。該兩種方法均具有很好的特異性。
　　4.將基于磁珠的核酸提取方法與RPALFD方法聯(lián)用，以適用于臨床樣品的現(xiàn)場診斷。
　　研究結(jié)果表明，本文建立的RPA方法在ORFV, CaPV, PCV2，PRV和PPV的檢測上具有簡單，快速，敏感性高和特異性強的特點。該方法既可應(yīng)用于