三種食源性致病菌多重環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)研究.pdf

1、近年來食品安全問題不斷，人們漸而不以為奇，甚或一度談“食”色變。食源性疾病是我國乃至世界范圍內(nèi)的首要食品安全問題，以及公共衛(wèi)生問題之一，給世界各國帶來了難以估量的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)影響。在所有食源性疾病致病因素包括微生物因素、化學(xué)物理以及有毒動(dòng)植物因素中，微生物因素是最重要的致病因素，高居第一位；而細(xì)菌在微生物中占絕大多數(shù)，所以食源性致病菌是我國食品安全和公眾健康面臨的最根本問題。沙門氏菌是最常見且最重要的致病菌，其血清型眾多，是我國細(xì)菌性

2、食源性疾病中位居第二位的致病菌。副溶血性弧菌大量分布于世界各地的近海水域，人類大多由于攝入生的或未熟的海產(chǎn)品而致病，其已成為我國乃至亞洲許多國家第一位的食源性致病菌。單核細(xì)胞增生李斯特菌可引起致命性的李斯特菌病，其在歐美國家十分常見，近年來在我國市售食品中也頻頻檢出，已成為我國最常見的食源性致病菌之一。對于上述三種致病菌，建立其快速篩查和診斷的方法十分必要。
　　總的來說，食源性致病菌的快速鑒定方法包括免疫學(xué)方法、生物傳感器技術(shù)以

3、及核酸檢測。免疫學(xué)方法如ELISA、IMS等依賴于抗原抗體的特異結(jié)合，抗干擾能力差。生物傳感器技術(shù)具有低穩(wěn)定、高成本的缺點(diǎn)。PCR及其衍生技術(shù)作為核酸檢測的經(jīng)典代表，在檢測靈敏度、穩(wěn)定性方面都大有增進(jìn)，但其對專業(yè)操作和精密儀器如溫度循環(huán)儀的依賴使其應(yīng)用至今仍局限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，越發(fā)難以滿足傳染病即時(shí)診斷的現(xiàn)實(shí)需求。核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)填補(bǔ)了這一缺憾，這些方法無需熱循環(huán)，在恒溫條件下即可實(shí)現(xiàn)核酸序列的特異擴(kuò)增，從而使核酸檢測從實(shí)驗(yàn)室走向現(xiàn)場

4、成為可能。
　　LAMP技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增，是核酸恒溫?cái)U(kuò)增的集大成者。其反應(yīng)在恒溫條件下，僅需一種類型的酶即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增；擴(kuò)增反應(yīng)在60min內(nèi)完成，且具有高特異性和類似于巢式PCR的靈敏度；快速、連續(xù)的LAMP反應(yīng)成就了其高擴(kuò)增效率，還可用于RNA的擴(kuò)增；其結(jié)果肉眼可判，也可利用濁度和熒光對其反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。由于LAMP反應(yīng)結(jié)合了以上特點(diǎn)，其自發(fā)明以來在各領(lǐng)域都有深入應(yīng)用，包括病原鑒定、基因診斷、環(huán)境樣品的快速檢測等。

5、>　　LAMP技術(shù)的發(fā)展似乎已十分完備，但美中不足的是，目前LAMP反應(yīng)大都局限于單靶標(biāo)檢測，即一次反應(yīng)只能檢測一個(gè)目的基因，多重LAMP的發(fā)展受到限制。究其原因，大致可歸結(jié)為一“易”一“難”：一是多重LAMP體系非特異擴(kuò)增之易；由于LAMP引物為4-6條，多重LAMP體系中引物數(shù)量就要數(shù)倍于此，引物間交叉反應(yīng)的幾率相應(yīng)增加，從而導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。二是多重LAMP體系目的基因區(qū)分之難；由于LAMP產(chǎn)物大小不等、長短不一，所以多重LAMP無

6、法像多重PCR那樣僅通過電泳就可對其體系中的多個(gè)目的片段進(jìn)行區(qū)分。這兩個(gè)因素是制約多重LAMP發(fā)展的瓶頸。鑒于以上分析，本研究主要有以下三部分內(nèi)容：
　　一．副溶血性弧菌、沙門氏菌、單增李斯特菌LAMP檢測方法的建立
　　分別以副溶血性弧菌tlh基因、沙門氏菌bcfD基因、單增李斯特菌iap基因?yàn)榘行蛄校O(shè)計(jì)相應(yīng)的LAMP引物，Blast序列分析進(jìn)一步驗(yàn)證引物特異性；綜合考慮擴(kuò)增效率和檢測靈敏度，選取最優(yōu)引物，建立LAMP反

7、應(yīng)體系。以相近的其他食源性致病菌DNA為模板評價(jià)其特異性，以PCR反應(yīng)為參照判定和評價(jià)其檢測靈敏度。實(shí)時(shí)濁度結(jié)果顯示，擴(kuò)增可在40min內(nèi)完成。特異性實(shí)驗(yàn)顯示，這三種致病菌的LAMP引物均只能擴(kuò)增其相應(yīng)的目的基因，而以其他相近致病菌DNA為模板的反應(yīng)和陰性對照均無擴(kuò)增出現(xiàn)，表明其高度特異。以PCR反應(yīng)作為比較的靈敏度實(shí)驗(yàn)顯示，該法靈敏度好，或具有優(yōu)于PCR的靈敏度。
　　二．副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌多重LAMP檢測方法

8、的建立
　　本實(shí)驗(yàn)旨在建立能夠同時(shí)檢測副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的多重LAMP反應(yīng)體系。引入引物濃度優(yōu)化的概念和意識(shí)，通過考察三種引物濃度組合的多重反應(yīng)體系對擴(kuò)增效率的影響，綜合考慮檢測成本，以確定最佳引物配比，并以此建立多重LAMP反應(yīng)體系，初步評價(jià)特異性和靈敏度。結(jié)果顯示，減少各LAMP引物濃度為其原濃度的一半（1.3μmol/L），以此建立的含有18條引物的多重LAMP反應(yīng)體系，在保證擴(kuò)增效率的同時(shí)，又能減小非特異

9、擴(kuò)增產(chǎn)生的可能。特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)這三種致病菌DNA或之一、或之二、或之三存在時(shí)，該多重LAMP都能夠?qū)⑵錂z測出來，其最低檢測濃度與相應(yīng)的單重LAMP靈敏度是一致的。該方法在某種程度上減少了工作量、節(jié)省了成本，適用于大量樣品檢測時(shí)的初步篩查和診斷。
　　三．沙門氏菌和副溶血性弧菌多重實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測方法的建立
　　本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種同時(shí)檢測并鑒別沙門氏菌和副溶血性弧菌的多重實(shí)時(shí)熒光LAMP方法，以打破“多重LAM

10、P體系目的基因區(qū)分之難”的瓶頸。其方法是在多重LAMP反應(yīng)體系中加入熒光染料EveGreen，在反應(yīng)結(jié)束后對多重LAMP產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，依據(jù)目的基因LAMP產(chǎn)物熔解溫度（Tm值）的不同以同時(shí)檢測沙門氏菌和副溶血性弧菌，并進(jìn)行區(qū)分。初步評價(jià)該實(shí)時(shí)熒光LAMP的特異性和靈敏度，并研究其定量能力。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙門氏菌bcfD基因和副溶血性弧菌toxR基因LAMP產(chǎn)物具有相對穩(wěn)定的Tm值，分別為86.25±0.06℃和84.

11、05±0.06℃；這兩個(gè)Tm值之間的差異可使二者在多重體系中被區(qū)分，在熔解曲線上表現(xiàn)為兩個(gè)峰值。特異性實(shí)驗(yàn)顯示，該方法能夠擴(kuò)增全部的沙門氏菌和副溶血性弧菌DNA，且7株沙門氏菌的Tm值統(tǒng)一落在86.5oC-86.8oC之間；表明該方法具有較好的檢測特異性。對沙門氏菌和副溶血性弧菌同時(shí)檢測和鑒別的靈敏度與多重PCR是一致的。該實(shí)時(shí)熒光LAMP定量能力評價(jià)實(shí)驗(yàn)表明，模板DNA濃度與反應(yīng)時(shí)間Cq值之間存在線性關(guān)系（R2=0.934），表明該法