基于分子邏輯門的食源性致病菌DNA檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、分子邏輯門最早是由DeSilva教授及其研究小組提出，他們于1993年首次將分子開(kāi)關(guān)發(fā)展為分子邏輯門并在Nature期刊上報(bào)道了一種基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的分子邏輯門。本論文利用DNA分子邏輯門技術(shù)結(jié)合電化學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種食源性致病菌的特征DNA進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)構(gòu)建標(biāo)記型發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA分子邏輯門、標(biāo)記發(fā)卡型莖部三螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子邏輯門、非標(biāo)記型三螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子邏輯門，分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA這三種食

2、源性致病菌的同時(shí)準(zhǔn)確有效檢測(cè)。本論文主要內(nèi)容如下:
　　(1)緒論部分首先以食品安全與食源性致病菌檢測(cè)對(duì)保障食品安全的重要意義出發(fā)介紹食源性致病菌檢測(cè)的主要方法，且闡述了各類方法的研究進(jìn)展，對(duì)傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代方法的優(yōu)缺點(diǎn)做了對(duì)比，重點(diǎn)介紹了本論文中應(yīng)用的檢測(cè)方法—DNA生物傳感器對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)方法。緒論后半部分介紹了分子邏輯門的概念，以及與本論文研究方法密切相關(guān)的DNA分子邏輯門的分類及其研究進(jìn)展。
　　(2)構(gòu)建了一種

3、基于二茂鐵標(biāo)記型發(fā)卡結(jié)構(gòu)檢測(cè)大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA的“OR”型邏輯門。依據(jù)文獻(xiàn)及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，借助專業(yè)軟件模擬計(jì)算，選擇合適的大腸桿菌特征基因序列、志賀氏菌特征基因序列。將其特征DNA作為目標(biāo)分子，由此設(shè)計(jì)符合條件的二茂鐵標(biāo)記型發(fā)卡結(jié)構(gòu)的DNA探針。以大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA作為輸入，修飾標(biāo)記二茂鐵探針?lè)肿拥碾姌O電流響應(yīng)信號(hào)作為輸出，構(gòu)建OR型邏輯門。達(dá)到快速同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌DNA、志賀氏菌DNA的目的。當(dāng)輸入大腸桿菌DNA

4、、志賀氏菌DNA中任意一個(gè)或同時(shí)輸入兩個(gè)目標(biāo)DNA分子時(shí)，電流減小率＞54％，當(dāng)沒(méi)有目標(biāo)DNA出現(xiàn)時(shí)，電流減小率＜54％。檢測(cè)E.coli-DNA所得結(jié)果:回歸方程為:y=-0.0027x+4.575，相關(guān)系數(shù)R=0.9962，其線性范圍為:1.0×10-7-7.0×10-7mol/L，檢出限:1.0×10-7mol/L。檢測(cè)Shi-DNA所得結(jié)果:回歸方程y=-0.0037x+4.54，相關(guān)系數(shù)R=0.9973，線性范圍為:1.0×1

5、0-7-7.0×10-7mol/L，檢出限:1.0×10-7mol/L。
　　(3)構(gòu)建了一種基于二茂鐵標(biāo)記型發(fā)卡莖部三螺旋結(jié)構(gòu)檢測(cè)沙門氏菌DNA、志賀氏菌DNA的“OR”型邏輯門。參考相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，確定志賀氏菌特征基因序列、沙門氏菌特征基因序列。借助軟件進(jìn)行模擬計(jì)算，選擇合適的志賀氏菌、沙門氏菌特征基因序列檢測(cè)目標(biāo)，在上一個(gè)實(shí)驗(yàn)原理基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，設(shè)計(jì)二茂鐵標(biāo)記型莖部三螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)卡式DNA探針。以志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA作

6、為輸入，修飾標(biāo)記二茂鐵探針?lè)肿拥碾姌O電流響應(yīng)信號(hào)作為輸出，構(gòu)建OR型邏輯門。達(dá)到同時(shí)快速檢測(cè)志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA的目的。當(dāng)輸入沙門氏菌DNA、志賀氏菌DNA中任意一個(gè)或同時(shí)輸入兩個(gè)目標(biāo)DNA分子時(shí)電流減小率＞83％，當(dāng)沒(méi)有目標(biāo)DNA出現(xiàn)時(shí)，電流減小率＜83％。檢測(cè)Sal-DNA所得結(jié)果:回歸方程為:y=-1.29log(Csal/mol)-6.819，相關(guān)系數(shù)R=0.9974，線性范圍:3.0×10-7-2.5×10-11mo

7、l/L，檢出限:2.5×10-11mol/L。檢測(cè)Shi-DNA所得結(jié)果:回歸方程y=-1.26log(Cshi/mol)-6.496，相關(guān)系數(shù)R=0.9965，線性范圍為:3.0×10-7-2.5×10-11mol/L，檢出限:2.5×10-11mol/L。
　　(4)在前期工作基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一種非標(biāo)記型三螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)檢測(cè)志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA的“AND”型邏輯門。選擇合適的志賀氏菌特征基因序列、沙門氏菌特征基因序列并設(shè)

8、計(jì)非標(biāo)記型三螺旋DNA探針。選用亞甲基藍(lán)作為電化學(xué)活性指示劑，利用亞甲基藍(lán)與DNA的相互作用，分別探究單鏈DNA、雙鏈DNA、三鏈DNA的雜交信號(hào)響應(yīng)。以志賀氏菌DNA、沙門氏菌DNA作為輸入，以亞甲基藍(lán)為指示劑的電極電化學(xué)信號(hào)作為輸出，構(gòu)建AND型邏輯門。達(dá)到快速同時(shí)檢測(cè)志賀氏菌、沙門氏菌DNA的目的。檢測(cè)Sal-DNA所得結(jié)果:回歸方程為:y=-1.207log(Csal/mol)x+14.172，相關(guān)系數(shù)R=0.9986，線性范圍