南美白對(duì)蝦中常見食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)及分子預(yù)測(cè)微生物模型的構(gòu)建.pdf

1、南美白對(duì)蝦是中國(guó)和亞洲其他地區(qū)最為重要的水產(chǎn)品之一，同時(shí)，因?yàn)槠湮兜栗r美、營(yíng)養(yǎng)豐富，也是這些區(qū)域最受歡迎的食品之一。副溶血性弧菌、單增李斯特菌和沙門氏菌是水產(chǎn)品中最為常見的三種食源性致病菌，已經(jīng)成為水產(chǎn)品中的重要威脅。微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估被視為解決這些潛在威脅的有效途徑，同時(shí)高通量檢測(cè)技術(shù)和高效的預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型能夠?yàn)槲⑸镲L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。因此，本文旨在探究（1）構(gòu)建一種高通量檢測(cè)技術(shù)用于生鮮南美白對(duì)蝦中副溶血性弧菌、單增李斯特

2、菌和沙門氏菌的快速檢測(cè)；（2）構(gòu)建一種活菌定量技術(shù)用于同時(shí)定量檢測(cè)生鮮南美白對(duì)蝦中活的副溶血性弧菌和單增李斯特菌；（3）構(gòu)建一個(gè)有效的分子預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型用于描述采收后生鮮南美白對(duì)蝦中自然存在的副溶血性弧菌的行為變化。本研究主要研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　1.生鮮南美白對(duì)蝦中副溶血性弧菌、單增李斯特菌及沙門氏菌快速檢測(cè)方法的構(gòu)建
　　本研究構(gòu)建了一種多重?zé)晒舛縋CR方法，用以同時(shí)檢測(cè)生蝦中常見的三種食源性致病菌：副溶血性

3、弧菌，單增李斯特菌以及沙門氏菌。通過(guò)26株受試菌株的驗(yàn)證試驗(yàn)，證明這種方法具有極高的特異性。運(yùn)用兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建方法評(píng)價(jià)該方法的擴(kuò)增效率，結(jié)果表明無(wú)論在純培養(yǎng)還是人工接種的蝦樣中，該方法都具有卓越的擴(kuò)增效率。同時(shí)，在人工接種的蝦樣中，測(cè)得該多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢測(cè)限低達(dá)102 CFU/g。最后，通過(guò)48個(gè)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，該方法與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果保持一致，而且相較于費(fèi)時(shí)費(fèi)力的傳統(tǒng)方法，該方法在提取DNA后只需要50分鐘就

4、能直接獲得生蝦中三種食源性致病菌的檢測(cè)結(jié)果。因此，這項(xiàng)快速高效的PCR技術(shù)可用于檢測(cè)水產(chǎn)品中的三種食源性致病菌，從而維護(hù)水產(chǎn)品的質(zhì)量和保障公眾的身體健康。
　　2.生鮮南美白對(duì)蝦中副溶血性弧菌及單增李斯特菌活菌定量方法的構(gòu)建
　　本研究首次構(gòu)建了一種疊氮溴化丙錠（PMA）結(jié)合多重實(shí)時(shí)熒光PCR活菌定量的方法，可用于同時(shí)定量檢測(cè)生鮮南美白對(duì)蝦中活的副溶血性弧菌和單增李斯特菌。通過(guò)PMA濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了100μM的PMA使用

5、濃度，可與多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相結(jié)合，從而抑制108 CFU/mL副溶血性弧菌和單增李斯特菌死菌DNA的擴(kuò)增。通過(guò)96株受試菌株的驗(yàn)證試驗(yàn)，證明這種方法具有極高的特異性。并運(yùn)用人工接種蝦樣構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定了該方法對(duì)于副溶血性弧菌和單增李斯特菌具有極佳的擴(kuò)增效率，分別為100％和106%。此外，該方法被成功地應(yīng)用于4℃條件下生蝦樣品中副溶血性弧菌和單增李斯特菌行為變化的描述。而且，對(duì)比于傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)方法，本方法從采樣到最終結(jié)果的輸

6、出僅需要5個(gè)小時(shí)。因此，這種全新的多重活菌定量技術(shù)可提供一種有效的工具用于水產(chǎn)品中常見食源性致病菌的監(jiān)控與分析和預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型的構(gòu)建，并為定量微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供可靠的數(shù)據(jù)，從而達(dá)到保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全和改善公共衛(wèi)生狀況的目的。
　　3.采收后生鮮南美白對(duì)蝦中自然存在的副溶血性弧菌分子預(yù)測(cè)微生物模型的建立與驗(yàn)證。
　　本研究建立了采收后南美白對(duì)蝦中自然存在的副溶血性弧菌在不同溫度下（4、7、15、20、25、30 oC）的分子

7、預(yù)測(cè)微生物學(xué)模型。選擇PMA實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)作為定量方法，運(yùn)用Baranyi模型進(jìn)行副溶血性弧菌一級(jí)模型的擬合，平方根模型和非線性阿倫尼烏斯方程進(jìn)行副溶血性弧菌二級(jí)模型的擬合，并通過(guò)同一區(qū)域生蝦樣品中的副溶血性弧菌在18、23、28℃下的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型的驗(yàn)證。結(jié)果顯示：自然存在的副溶血性弧菌在4、7 oC條件下緩慢失活，失活速率分別為-0.019 Log CFU/g/h和-0.025 Log CFU/g/h，而在15、20、25、3

8、0 oC條件下，自然存在的副溶血性弧菌處于生長(zhǎng)狀態(tài)，生長(zhǎng)速率分別為0.044 Log CFU/g/h、0.105 Log CFU/g/h、0.179 Log CFU/g/h和0.336 Log CFU/g/h，延滯期分別為15.451 h、7.259 h、4.427 h和3.741h。平方根模型與非線性阿倫尼烏斯模型的驗(yàn)證指標(biāo)A f值與B f值均處于0.9-1.1之間，說(shuō)明該模型對(duì)采收后南美白對(duì)蝦中自然存在的副溶血性弧菌的生長(zhǎng)行為具有良