乳酸對常見食源性致病菌的抗菌活性與作用機理.pdf

1、新鮮農(nóng)產(chǎn)品的微生物安全一直是關(guān)系公眾健康的嚴(yán)重問題。新鮮或鮮切果蔬的消費由于營養(yǎng)和健康的關(guān)系而受到青睞，但不幸的是，隨著產(chǎn)品消費數(shù)量的增加，與此相關(guān)的食源性疾病的爆發(fā)也增加了。與農(nóng)產(chǎn)品消費有關(guān)的食源性疾病的爆發(fā)對生產(chǎn)者和加工者以及消費者來說代價都是相當(dāng)大的。所以，果蔬的保鮮也成為深受消費者關(guān)心的問題，消費者不僅關(guān)心果蔬的質(zhì)地、色澤和營養(yǎng)品質(zhì)，同時也對果蔬的微生物安全及保鮮劑的安全使用非常重視。
　　本文以致病性的大腸桿菌、沙門菌和

2、單增李斯特菌作為目標(biāo)微生物，首先以湖北地區(qū)特色蔬菜藕帶為載體，研究了乳酸的抗菌作用效果，然后從細(xì)胞和分子層面，通過生物學(xué)手段研究了乳酸對三種常見致病菌細(xì)胞的表面特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能與代謝等方面的影響，由此探討乳酸的抗菌機理。主要研究結(jié)果如下:
　　將天然抗菌劑乳酸應(yīng)用在鮮切藕帶上，結(jié)果表明0.5％以上濃度的乳酸均能有效地減少藕帶上常見食源性致病菌（沙門菌、大腸桿菌和李斯特菌）的含量。用0.5％和2.0％的乳酸處理藕帶時，分別可

3、以降低1.5 log CFU/g和2.3 log CFU/g，隨著乳酸濃度的增加其抗菌有效性增加。同時，經(jīng)乳酸處理過的藕帶色澤比較好，能明顯提升藕帶的色澤品質(zhì)，且在貯藏期間下降緩慢。其中對a*值的影響較為突出，乳酸處理對藕帶紅度值（a*值）的積累貢獻(xiàn)是最小的。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸具有比已廣泛商業(yè)使用的次氯酸鈉在抗菌和改善藕帶色澤方面的效果都更佳。
　　研究結(jié)果表明，沙門菌、大腸桿菌及李斯特菌在近中性及偏酸性的pH值條件范圍內(nèi)均可以正

4、常生長。另外，結(jié)合許多常見即食食物的典型pH值為5.8和6.5，因此將分別選擇pH5.8和pH6.5作為條件來考察同一pH值條件下乳酸與無機酸（鹽酸）對細(xì)菌生長影響的差異。通過研究發(fā)現(xiàn)，在近中性(pH6.5)環(huán)境下，四種不同濃度的乳酸對三種菌生長的抑制效果普遍優(yōu)于相同pH6.5的鹽酸組和各自的對照組，而pH6.5的鹽酸組的生長趨勢與對照組幾乎一樣，0.5％及以上濃度的乳酸具有明顯的抑制效果，其中1％和2％的乳酸幾乎能完全抑制三種菌的生長

5、。而在偏酸性(pH5.8)環(huán)境下，0.25％的乳酸即具有明顯的抑菌效果，0.5％及以上濃度的乳酸幾乎可以完全抑制三種目標(biāo)菌的生長。因此，在相同近中性(pH6.5)和偏酸性(pH5.8)環(huán)境條件下，乳酸對目標(biāo)致病菌生長的抑制效果優(yōu)于無機酸（鹽酸），且隨著pH值的降低差異越大。
　　作為細(xì)胞抵御外來抗菌劑作用的第一道屏障，菌體細(xì)胞的表面特性及細(xì)胞膜的完整性會首先受到威脅。本研究針對乳酸處理后的沙門菌、大腸桿菌和李斯特菌表面電荷（ζ-電

6、位）、表面疏水性、膜的完整性及掃描電鏡圖像的變化來揭示乳酸對菌體細(xì)胞表面特性的影響。ζ-電位的結(jié)果顯示乳酸處理對三種菌體的表面電荷影響嚴(yán)重，乳酸處理后的菌體表面初始ζ-電位為負(fù)，隨著處理時間的延長菌體表面的負(fù)電荷逐漸減少甚至變?yōu)檎姾?。通過對乳酸處理后菌體表面疏水性的測定可以發(fā)現(xiàn)，處理后的三種菌體細(xì)胞表面疏水性都顯著升高(p＜0.05)。結(jié)果還表明，細(xì)胞內(nèi)鉀離子外滲的結(jié)果與表面電荷的改變是相符的，表明細(xì)菌表面的ζ-電位受滲漏出胞外帶正電

7、荷的K+影響很大。此外，從掃描電鏡(SEM)圖像可以明顯地觀察到，經(jīng)乳酸處理的三種菌均出現(xiàn)有破損，其中大腸桿菌尤為明顯。
　　通過考察沙門菌、大腸桿菌和李斯特菌細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和胞內(nèi)物質(zhì)的改變來進一步研究揭示乳酸對細(xì)菌細(xì)胞的影響與作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，0.5％的乳酸可以使三種菌體細(xì)胞在作用2h后完全失活，同時會伴隨蛋白質(zhì)的滲漏。SDS-PAGE圖像上乳酸處理組的蛋白條帶濃度的明顯變淺進一步驗證了乳酸可對三種菌體的細(xì)胞膜造成破壞，且很有可

8、能對菌體蛋白的含量和活性造成影響。菌體細(xì)胞Z-均直徑的測定結(jié)果顯示，經(jīng)乳酸處理的三種菌體細(xì)胞均變小，對沙門菌來說尤其明顯，且在透射電鏡(TEM)圖像上可以明顯觀察到這一現(xiàn)象。此外，還可以從TEM圖像中明顯觀察到乳酸處理組中已破壞的細(xì)胞膜，聚集或無規(guī)則分布的菌體細(xì)胞內(nèi)容物。總的來說，結(jié)果顯示乳酸的處理可以使細(xì)菌細(xì)胞的生理和形態(tài)均發(fā)生變化，這也是乳酸發(fā)揮其抗菌作用的機制之一。
　　采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究乳酸處理對三種目標(biāo)菌蛋白質(zhì)組的

9、影響。在沙門菌組中共發(fā)現(xiàn)有15個蛋白質(zhì)差異點，在大腸桿菌試驗中共發(fā)現(xiàn)有19個蛋白質(zhì)差異點，在李斯特菌組中共發(fā)現(xiàn)47個蛋白質(zhì)差異點。沙門菌、大腸桿菌和李斯特菌試驗中經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定的蛋白質(zhì)差異點分別為10個、15個和43個，均包括存在質(zhì)差異的點（處理后消失或新生成）和存在量差異的點（處理后蛋白量升高或降低的點）。通過對成功鑒定的蛋白點進行GO分析和KEGG pathway分析可發(fā)現(xiàn)，乳酸對三種菌的細(xì)胞膜和胞內(nèi)物質(zhì)均造成破壞，對細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代