多色實時PCR用于食源性致病菌的廣譜檢測與識別.pdf

1、快速、有效、高通量地對食源性致病菌進行檢測與識別對于疾病預(yù)防與控制十分重要。食源性致病菌多種多樣，如何從一系列懷疑對象中確定特定的病原已成為亟待解決的重要課題。本論文綜合運用實時PCR、多色組合探針編碼(MCPC)技術(shù)和相同標(biāo)簽輔助-無引物二聚體(HAND)系統(tǒng)，致力于對食源性致病菌的廣譜檢測與識別。 第一章，綜述食源性致病菌的檢測現(xiàn)狀，介紹傳統(tǒng)檢測方法、免疫學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。針對目前實時PCR

2、存在檢測通量偏低的問題，分析其中的技術(shù)瓶頸，提出采用多色組合探針編碼技術(shù)的思路。 第二章，通過改良分子信標(biāo).多重?zé)晒釶CR的方法實現(xiàn)食源性致病菌的廣譜檢測。本章選擇7種致病弧菌作為研究對象，通過兩個四色實時PCR體系實現(xiàn)了7種弧菌的同時檢測，該體系具有特異性好、靈敏度高、快速簡便等優(yōu)點。第一個四色實時PCR體系能同時對O1群霍亂弧菌、O139群霍亂弧菌、副溶血弧菌及其毒力株進行檢測，對單一目標(biāo)菌的檢測靈敏度可達29.6-630

3、CFU/反應(yīng)；第二個四色實時PCR體系能同時對創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌和河弧菌進行檢測，對單一目標(biāo)菌的檢測靈敏度可達29.5-295 CFU/反應(yīng)。 第三章，通過廣譜PCR結(jié)合置換探針基因分型的方法實現(xiàn)食源性致病菌的廣譜檢測與識別。通過廣譜PCR擴增食源性致病菌的16S rRNA和23S rRNA基因的保守區(qū)域，利用雙鏈置換探針-MCPC技術(shù)針對擴增產(chǎn)物的差異序列區(qū)分不同產(chǎn)物，實現(xiàn)了在單管中對9類常見食源性致病菌的識別。該方

4、法覆蓋常見的食源性致病菌，包括致病性大腸桿菌和志賀菌、沙門菌、單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、變形桿菌和化膿性鏈球菌。對129株菌株的分型結(jié)果與已知的鑒定結(jié)果一致。 第四章，以特異基因作為靶標(biāo)，建立HAND系統(tǒng)結(jié)合改良分子信標(biāo)-MCPC技術(shù)的方法實現(xiàn)食源性致病菌的廣譜檢測與識別。以7種致病弧菌作為研究對象，通過HAND系統(tǒng)結(jié)合MCPC技術(shù)，在一個PCR管中實現(xiàn)了對O1群霍亂弧菌、O139群霍亂弧

5、菌、副溶血弧菌及其毒力株、溶藻弧菌、河弧菌、擬態(tài)弧菌和創(chuàng)傷弧菌任意一種模板的檢測。該方法具有靈敏度高(檢測靈敏度為2-100拷貝/反應(yīng))，特異性好，檢測通量高(一次能分辨7種靶序列的任意一種)，在寬泛的模板濃度范圍(至少6個數(shù)量級)內(nèi)具有良好的定量能力(R2>0.99)。該方法通過了145株菌株的特異性驗證，證明其結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。 本論文利用多色實時PCR技術(shù)提供了針對食源性致病菌廣譜檢測與識別的三種解決方案，這些方法具有操作簡