多重PCR檢測(cè)肉及肉制品中四種食源性致病菌的研究.pdf

1、食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來(lái)食品安全問(wèn)題的一個(gè)顯著特點(diǎn)，在各種食品安全事件中，細(xì)菌性食物中毒則是食物中毒的重要因素。常見(jiàn)的食源性致病菌主要有金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、單核增生李斯特氏菌、致瀉性大腸桿菌等。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)食品中致病菌主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要3～5 d才能完成，且靈敏度較低。近年來(lái)，PCR針對(duì)某一種或一類致病菌的檢驗(yàn)方法被建立起來(lái)，但是一旦檢測(cè)的方向有誤就會(huì)造成時(shí)間和藥品的浪費(fèi)。

2、因此，急需建立一種快速有效且通量較高的檢測(cè)方法。 本文根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因nuc、沙門(mén)氏菌的侵染性質(zhì)?？乖瑽基因ipaB、志賀氏菌的侵染性質(zhì)?？乖璈基因ipaH、單核增生李斯特氏菌的內(nèi)化素A基因inlA設(shè)計(jì)了四對(duì)特異性引物，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)四種食源性致病菌的檢測(cè)。試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)多重PCR反應(yīng)體系中引物添加量、鎂離子濃度、dNTPmixture添加量及退火溫度和循環(huán)數(shù)等影響要素進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜的多重

3、PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，其反應(yīng)體系為:5μL10xPCR buffer,3.5μL 25 mmol/L Mg2+，5.5μLdNTPmixture，正向引物各2μL，反向引物各2μL，0.8μL(5UμL-1)Taq酶，模板為FTA膜，雙蒸水補(bǔ)足至50gL；多重PCR.擴(kuò)增程序?yàn)?多重PCR反應(yīng)采用冷啟動(dòng)，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55.5℃退火45s，72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5 min,反應(yīng)

4、產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果對(duì)多重PCR.擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了DNA測(cè)序，登錄Genebank將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上blast，從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。 本研究共檢測(cè)了20株菌，2株金黃色葡萄球菌、4株沙門(mén)氏菌、4株志賀氏菌、1株單核增生李斯特氏菌均為陽(yáng)性結(jié)果；9株其它腸桿菌均為陰性結(jié)果。將四種致病茵隨機(jī)組合，均能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出結(jié)果，因此該多重PCR反應(yīng)特異性較強(qiáng)。 本方法對(duì)四種食源性致病菌

5、的純菌培養(yǎng)物單茵檢測(cè)靈敏度均為lO1cfu/mL:同時(shí)檢測(cè)四種食源性致病菌的靈敏度金黃色葡萄球菌為102 cfu/mL、沙門(mén)氏菌102cfu/mL、志賀氏菌101cfu/mL、單核增生李斯特氏菌lO1cfu/mL。 對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，將多重PCR.方法與國(guó)標(biāo)進(jìn)行比較，確定多重PCR方法對(duì)四種致病菌的敏感性均為100％；特異性分別為:金黃色葡萄球菌為95.％、沙門(mén)氏菌為95.7％、志賀氏菌為91.3％、單核增生李斯特氏菌為94.