引入擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食源性致病菌多重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、DevelopmentandapplicationofinternalamplificationcontrolformultiplexPCRdetectionoffoodbornepathogensIk—The“submittedt01laeSlSSUQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofEngineeringJia

2、ngYanjun(CollegeofFoodScienceandEngineering)Supervisor：ProfiZhaoHongkunQingdaoChmaJune，2013青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要引入擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食源性致病菌多重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用摘要近年來，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行快速檢測(cè)食源性致病菌的報(bào)道較為多見，但由于其結(jié)果常常出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性而存在質(zhì)疑。本研究針對(duì)這一問題，以畜禽體內(nèi)常見的兩種腸道致病菌一一沙門氏菌

3、、大腸桿菌0157：H7為目的菌，對(duì)常規(guī)的PCR方法加以改進(jìn)，并進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用，獲得了更為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。本文就該項(xiàng)試驗(yàn)的全部過程報(bào)告如下。選擇具有特異性的沙門氏菌invA基因、大腸桿菌0157：H7∥iC基因作為靶基因，設(shè)計(jì)引物，改良二重PCR方法。試驗(yàn)過程中對(duì)影響PCR擴(kuò)增的三種主要因素～一引物濃度、M92濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜的二重PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序：509L反應(yīng)體系中，10PCRBuffer59L，dNTP終物

4、質(zhì)的量為10pmol，M92終物質(zhì)的量為75pmol，25UTaq酶，沙門氏茵、大腸桿菌0157：H7引物終物質(zhì)的量均為10pmol；擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃，5rain；變性：94℃，30s，退火：60℃，40s，延伸：72℃，40s，30個(gè)循環(huán)；延伸：72“C，10min，4℃保存。特異性試驗(yàn)中，加入其它7種常見的食源性致病菌，引物無非特異性擴(kuò)增，人工污染雞肉、牛肉、豬肉樣本，兩種致病菌的檢出限均可達(dá)2101CFU／ml，模擬實(shí)際樣

5、本檢測(cè)，加入高濃度背景菌群，當(dāng)背景茵群濃度為107CFU觸、108CFU／ml時(shí)，102CFUtml、103CFU／ml沙門氏茵和大腸桿菌0157：H7均可檢出，3背景菌群濃度為109CFU／ml，103CFU／ml沙門氏菌和大腸桿菌0157：H7均可檢出。未檢出樣本增菌6h后，又可檢出這兩種待檢目的茵。在與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比中，PCR法與其結(jié)果一致，證明了該法的準(zhǔn)確性。為避免PCR假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，本次研究設(shè)計(jì)了一段人工構(gòu)建的D

6、NA序列作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(IAC)引入PCR體系中以指示假陰性，該序列不僅與兩種待檢菌沙門氏茵、大腸桿茵0157：H7的目的基因同源性很低(分別為361％、442％)，而且與其他常見的食源性致病菌的同源性均很低，因此可用于其他致病茵的PCR檢測(cè)。通過兩次克隆試驗(yàn)得到擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后引入已優(yōu)化的二重PCR法中，得到不影響原二重PCR靈敏度的最優(yōu)IAC濃度04留pl。以禽肉樣本均質(zhì)液為抑制物，倍比稀釋后加入隊(duì)CPCR體系中，測(cè)定