引入擴增內標的食源性致病菌多重PCR檢測方法的建立與應用.pdf

1、DevelopmentandapplicationofinternalamplificationcontrolformultiplexPCRdetectionoffoodbornepathogensIk—The“submittedt01laeSlSSUQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofEngineeringJia

2、ngYanjun(CollegeofFoodScienceandEngineering)Supervisor：ProfiZhaoHongkunQingdaoChmaJune，2013青島農業(yè)大學碩士學位論文摘要引入擴增內標的食源性致病菌多重PCR檢測方法的建立與應用摘要近年來，應用PCR方法進行快速檢測食源性致病菌的報道較為多見，但由于其結果常常出現(xiàn)假陽性或假陰性而存在質疑。本研究針對這一問題，以畜禽體內常見的兩種腸道致病菌一一沙門氏菌

3、、大腸桿菌0157：H7為目的菌，對常規(guī)的PCR方法加以改進，并進行了實際應用，獲得了更為準確的檢測結果。本文就該項試驗的全部過程報告如下。選擇具有特異性的沙門氏菌invA基因、大腸桿菌0157：H7∥iC基因作為靶基因，設計引物，改良二重PCR方法。試驗過程中對影響PCR擴增的三種主要因素～一引物濃度、M92濃度、退火溫度進行優(yōu)化，確定了適宜的二重PCR反應體系和擴增程序：509L反應體系中，10PCRBuffer59L，dNTP終物

4、質的量為10pmol，M92終物質的量為75pmol，25UTaq酶，沙門氏茵、大腸桿菌0157：H7引物終物質的量均為10pmol；擴增程序為：預變性94℃，5rain；變性：94℃，30s，退火：60℃，40s，延伸：72℃，40s，30個循環(huán)；延伸：72“C，10min，4℃保存。特異性試驗中，加入其它7種常見的食源性致病菌，引物無非特異性擴增，人工污染雞肉、牛肉、豬肉樣本，兩種致病菌的檢出限均可達2101CFU／ml，模擬實際樣

5、本檢測，加入高濃度背景菌群，當背景茵群濃度為107CFU觸、108CFU／ml時，102CFUtml、103CFU／ml沙門氏茵和大腸桿菌0157：H7均可檢出，3背景菌群濃度為109CFU／ml，103CFU／ml沙門氏菌和大腸桿菌0157：H7均可檢出。未檢出樣本增菌6h后，又可檢出這兩種待檢目的茵。在與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法試驗結果對比中，PCR法與其結果一致，證明了該法的準確性。為避免PCR假陰性結果的出現(xiàn)，本次研究設計了一段人工構建的D

6、NA序列作為擴增內標(IAC)引入PCR體系中以指示假陰性，該序列不僅與兩種待檢菌沙門氏茵、大腸桿茵0157：H7的目的基因同源性很低(分別為361％、442％)，而且與其他常見的食源性致病菌的同源性均很低，因此可用于其他致病茵的PCR檢測。通過兩次克隆試驗得到擴增內標，其PCR擴增產物純化后引入已優(yōu)化的二重PCR法中，得到不影響原二重PCR靈敏度的最優(yōu)IAC濃度04留pl。以禽肉樣本均質液為抑制物，倍比稀釋后加入隊CPCR體系中，測定