肺炎常見致病菌及其耐藥特性快速識別生物學(xué)芯片的構(gòu)建.pdf

1、目的:肺炎是世界上常見的一種感染性疾病，可發(fā)生在各個年齡階段，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。細(xì)菌是肺炎最重要的致病原之一，不能及時明確致病菌的種類及其耐藥特性往往導(dǎo)致細(xì)菌性肺炎治療失敗。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是檢測細(xì)菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但需要的時間長，對于一些菌種檢出率低，不能滿足臨床快速診斷的需求。同樣，抗菌藥物敏感性試驗雖然能直觀的反應(yīng)結(jié)果，但該方法所需時間長，影響因素多，而且對培養(yǎng)條件苛刻的細(xì)菌不適用，不能及時指導(dǎo)臨床用藥。本實驗擬構(gòu)建常見肺炎致病菌

2、及其相關(guān)耐藥基因的檢測生物學(xué)芯片，為臨床早診斷和早治療提供檢測手段。
　　方法:首先設(shè)計靶基因的引物和探針，其中肺炎致病菌鑒定芯片選取常見肺炎致病菌，以16S rDNA和特異基因作為檢測的靶基因，肺炎致病菌耐藥基因檢測芯片則選取臨床意義明確的耐藥基因，從PubMed數(shù)據(jù)庫中下載所有目的序列，通過序列比對設(shè)計出所需的引物和探針。然后進(jìn)行引物探針的篩選、質(zhì)粒參考品的構(gòu)建、多重不對稱PCR條件的優(yōu)化，主要是對引物間的搭配和引物濃度等擴(kuò)增

3、體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。最后對芯片的性能進(jìn)行評價，以質(zhì)粒參考品對芯片的靈敏度進(jìn)行驗證，以標(biāo)準(zhǔn)菌株或質(zhì)粒菌對芯片特異性進(jìn)行驗證，以陽性參考品對芯片重復(fù)性進(jìn)行驗證，如果有靈敏度低或特異性差的探針需要重新設(shè)計和驗證。
　　結(jié)果:根據(jù)肺炎致病菌流行病學(xué)特點，選取了15種細(xì)菌作為靶致病菌，包括肺炎鏈球菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎衣原體、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌、肺炎支原體、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、糞腸

4、球菌、屎腸球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、大腸埃希菌和陰溝腸桿菌。肺炎致病菌鑒定芯片，以致病菌16S rDNA和特異基因為靶基因片段，成功構(gòu)建了15種菌的30個質(zhì)粒參考品，篩選出了16對引物和32條探針。肺炎致病菌耐藥基因檢測芯片，則以24種耐藥基因為目的片段，成功構(gòu)建了24個質(zhì)粒參考品，篩選出了24對引物和27條探針。兩種芯片均成功建立了多重PCR的反應(yīng)條件和擴(kuò)增體系，芯片靈敏度均能達(dá)到103copies/μl，能正確檢測出目的基因，通過重復(fù)性檢驗