桑疫病致病菌的快速分離鑒定及其活體定量方法.pdf

1、由致病性桑丁香假單胞菌(Pseudomonas syringaepv. mori)引起的桑疫病是我國一種嚴重的作物病害。由于缺乏有效的防控措施，該病害每年給我國造成較大的經(jīng)濟損失。近年間，早期診斷技術作為植物病害防控的重要手段漸趨流行，通過對病原菌進行早期檢測，提前預測病害疫情的嚴重性，從而制定合理有效的防治措施。
　　建立了一種快速篩選致病性桑丁香假單胞菌的方法。首先依據(jù)經(jīng)低溫處理之后的致病性桑丁香假單胞菌能產(chǎn)生穩(wěn)定熒光效應進行

2、初篩，然后通過檢測特異性的hrpZ致病基因進行復篩，最后根據(jù)回接驗證，細胞形態(tài)學和16S-rDNA分子生物學鑒定，從而得到Psm13-7、Psm14-1、Psm14-7、Psm15-2四株能引起典型桑疫病癥狀的致病菌株。整個分離篩選過程僅僅花費15 d左右的時間，與傳統(tǒng)方法相比，分離時間縮短了近60天，分離效率提高了70％。該方法的成功構建為丁香假單胞其他致病變種菌株的分離篩選提供可靠的參照依據(jù)。
　　利用特異性地引物對，構建了致

3、病性桑丁香假單胞菌的熒光定量PCR檢測方法。通過將致病性桑丁香假單胞菌與其他致病變種的丁香假單胞菌進行 hrpZ致病基因的差異性片段分析，設計篩選了一對適宜快速檢測致病性桑丁香假單胞菌的特異性引物對Psm240F/Psm434R。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，結果表明該引物對可從致病性桑丁香假單胞菌中擴增出大小為195 bp的DNA片段，而對其他致病變種的丁香假單胞菌及其他種屬的病原菌均沒有擴增。以致病性桑丁香假單胞菌全基因組 DNA和菌懸液分別

4、為模板進行熒光定量PCR檢測，在6×10-5~6 ng/μL濃度范圍內(nèi)，DNA濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關系，線性方程為y=-3.22469x+14.03445,R2=0.99709，最低檢測限為60 fg/μL，在102~108CFU/mL濃度范圍內(nèi)，菌液濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關系，線性方程為y=-4.56215x+46.91167,R2=0.98872，最低檢測限為102CFU/mL。該方法的成功構建為桑疫病的早期診斷提供了可靠

5、的技術支持。
　　利用疊氮溴化丙錠(PMA)耦合熒光定量PCR方法，構建了致病性桑丁香假單胞菌的活體定量方法。通過對該致病菌細胞懸浮液進行預處理，使用濃度為20ng/μL的PMA，黑暗孵育10 min，曝光10 min，可完全抑制濃度為108 CFU/mL死菌中的DNA，且不會對活菌 DNA的擴增造成影響。在101~108 CFU/mL濃度范圍內(nèi)，PMA-qPCR的Ct值與菌濃的對數(shù)呈良好的線性關系，線性方程為y=-3.57193